| 研究課題/領域番号 |
17580107
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
食品科学
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| 研究機関 | 東京農工大学 |
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研究代表者 |
服部 誠 東京農工大学, 大学院共生科学技術研究院, 助教授 (40221501)
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| 研究分担者 |
好田 正 東京農工大学, 大学院共生科学技術研究院, 助手 (20302911)
戸塚 護 東京大学, 大学院農学生命科学研究科, 助教授 (70227601)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| キーワード | β・ラクトグロブリン / 低アレルゲン化 / バイオハイブリッド / Pichia pastoris / タンパク質工学 |
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| 研究概要 |
本研究においては、食品タンパク質として、牛乳中の主要な乳清タンパク質であるβ-ラクトグロブリン(BLG)を機能改変のターゲットとして用い、タンパク質工学的手法により糖鎖導入を行ったバイオハイブリッドを作出し、BLGのネイティブ構造、疎水性物質結合能を維持した状態で、乳化性等の機能特性の向上と低アレルゲン化を同時に達成すること目的として研究に着手した。
酵母Pichia pastoris発現系を用いてグリコシル化BLGとしてP153A、D28N、D137N/A139Sを調製した。グリコシル化BLGは、部位特異的アミノ酸置換によりN-型グリコシル化配列Asn-X-Ser/Thrを導入することにより作製した。変異を導入したcDNAをPichia発現ベクターpPICZαAに挿入し、ヒートショック法によりP. pastoris KM11H株へ形質導入し、発現分泌させた。分泌タンパク質をイオン交換クロマトグラフィーにより精製後、SDS-PAGEを行った結果、分子量はいずれの変異体も24KDaであり、約6KDaの糖鎖の付加を認めた。
グリコシル化BLGの機能については、乳化性と免疫原性を調べた。グリコシル化BLGのうち糖鎖結合型D28Nの乳化性について、pH7.0におけるO/Wエマルションを調製し濁度法により評価した。BLGと比較して、乳化活性は向上したものの、乳化安定性についてはほぼBLGと同程度であった。次に、BALB/cマウスにBLGあるいはグリコシル化BLGをフロイントのアジュバントとともに免疫後、抗血清を得、その反応性を非競合法ELISAにより解析した。その結果、P153Aにおいて、BLGの免疫原性の低下を達成することができた。また、C末端側の部位特異的グリコシル化(D137N/A139S)による、BLGの免疫原性の低下傾向が示唆された。
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