| 研究概要 |
機能遺伝子を用いた硫酸還元細菌(SRB)の活性評価法の開発のため,異化的硫酸還元過程の最終段階で働く亜硫酸還元酵素をコードしている遺伝子(dsr)の解析を行った。データベースに登録されている塩基配列をもとにPCRプライマーを作成した。SRBの19種27株からDNAを抽出し,作成したプライマーを用いてPCRを行ったところ,全ての株で予想された長さのPCR産物が得られた。数種の非SRBからはPCR産物の増幅は認められなかった。さらに,河口堆積物および密度成層湖水から抽出したDNAを鋳型にPCRを行い,PCR産物のクローンの塩基配列を決定したところ,全てのクローがdsrであった。これらの結果から,作成したプライマーはSRBのdsrに特異的であることが確認できた。
次に,競合鋳型DNAをプラスミドベクターに組み込み,これを鋳型としてT7プロモーターを用いて競合RNAを作成した。Desulfovibrio desulfuricans DSM642^Tを用いて異なる温度で培養し,一菌体あたりの硫酸還元活性の異なる細胞を調整した。各温度の増殖段階の異なる細菌細胞から全RNAを抽出し,上述の競合鋳型RNAを用いて競合RT-PCRによってdsrの転写量を定量したところ,いずれの温度でも対数増殖期において,一菌体あたりのdsrの転写量が最も多かった。また,菌体当たりの硫酸還元活性が異なれば細胞内のdsrのRNA量が異なり,SRB細胞の状態によって細胞当りのdsrのmRNAが変化することが明らかとなった。環境中のdsr mRNAを直接定量することによって,SRBの状態を推察することが可能であると考えられる。
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