| 研究概要 |
実験動物としてマウスを使用し、卵巣内の生殖幹細胞の検索および採取法についての検討を行った。まず,供試動物にDNA合成期の細胞を標識するために5-ブロモ2'-デオキシウリジン(BrdU)を腹腔内投与し、1または2時間後に卵果を採取し、常法により組織切片を作製し、抗BrdU抗体および抗Vasaホモログ抗体を一次抗体として、蛍光免疫組織化学法により二重染色を施し、共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して観察した。Vasaホモログの発現は卵胞内の卵母細胞とともに、卵巣表面の細胞の一部に観察された。BrdUの取り込みは主に顆粒層細胞に認められたが、卵巣表面のVasa陽性細胞においてはわずかな反応が散見されるのみで明瞭な反応は観察されなかった。BrdU標識の条件および別の増殖細胞特異抗原の発現についても検討を行っている。また、卵巣から生殖幹細胞を採取するために、同様にBrdU投与後、卵巣を採取し、ディスパーゼまたはコラゲナーゼにより酵素処理して細胞浮遊液を作製し、ナイロンメッシュ濾過およびPercoll密度勾配遠心分離による分画を行った。各段階の細胞浮遊液の塗抹標本について蛍光免疫組織化学法によりVasaホモログ発現およびBrdU取り込みを検索した。ディスパーゼと比較してコラゲナーゼ処理した細胞浮遊液ではVasaホモログ発現またはBrdU取り込みについて陽性である細胞が多く観祭された。40μmのメッシュで濾過後の分画に小型のVasaホモログ陽性細胞が存在したがBrdUの取り込みは観察されず、原始卵胞中の卵母細胞である可能性も高い。Percoll密度勾配遠心分離によりVasaホモログ陽性細胞の含まれる分画を回収したが、Vasaホモログ陰性細胞の混入率が高く、処理法の改良が必要である。
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