| 研究概要 |
動物の急性期蛋白であるα_1酸性糖蛋白(AGP)の糖鎖変動の意義を解明し,各種疾病の病態把握,診断,予後判定に応用することを目的として,まず,本年はELISA測定法の確立のための本糖蛋白の精製とモノクローナル抗体の作製ならびにlectin affinityによる糖鎖解析を試みた。
1)動物AGPの分離精製
ネコの腹水を材料として,硫安沈殿,酸沈殿,イオン交換カラム法,ゲルろ過法を組み合わせてAGPを分離精製した。この精製蛋白はSDS-PAGEで分子量40〜50kDaに淡い染色性を示すbroadな蛋白バンドを示し,糖蛋白であることが示唆され,また硫安・酸に対して高い可溶性を持ち,等電点3.7以下であることから,AGPであることが確認された。アミノ酸配列解析ではN末端がブロックされていた。
2)精製AGPに対するモノクローナル抗体の作製
精製AGPをBalb/cマウスに免疫し,常法に従ってモノクローナル抗体を作成した.その結果,8クローンが得られ,そのアイソタイプは(L鎖)はIgG_1(λ鎖),IgG_<2b>(λ鎖),IgA(κ鎖)であった。Western blot解析では,いづれのMabも還元状態ではAGPを認識せず,非還元状態のAGPを認識することから,これらはAGPの立体構造を認識することが示唆された。また,競合ELISA法によるエピトープ解析の結果から,今回得られたMabは同一あるいはオーバーラップするエピトープを認識する可能性が示された。
3)lectin affinityによる糖鎖解析
Western blot法によるlectin affinityにより,AGPの糖鎖解析を試みた。その結果,ネコAGPはConA,DSA,SAA,UEA-1と結合したことから,精製画分には混合型2分岐グリカンあるいは3分岐以上のグリカンをもつもの,シアル酸とフコースが付加されているものが存在すると考えられた。
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