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Bacillus thuringiensis MM50G2株クリスタルに由来する29kDa蛋白質(MM29kD)は、T細胞由来の白血病ガン細胞Jurkatに対して強い細胞致死作用を示す。本研究ではMM29kDとGST(Glutathione-S-transferase)の融合蛋白質(GST-MM29kD)を作製、精製して実験に用いた。GST-MM29kDのJurkatに対する毒性はEC50が15.3ng/mlである。一方、別の方法で精製した遊離MM29kDはEC50が0.4-0.5ng/mlである。
MM29kDはJurkatに対して強い認識結合能があり、細胞表面に結合することが認められている。これを決定する要因は標的細胞表面の結合蛋白質であり、これがMM29kD受容体の有力候補であると考えられる。本研究ではJurkat細胞表面のMM29kD結合蛋白質の探索を行った。昨年度までの研究で、標的細胞表面のGPIアンカー蛋白質およびCD7がMM29kD結合および感受性の決定に与っていることが強く示唆され、この両者のいずれか又は両方がMM29kD受容体としての機能を果たしていると考えられた。
今年度は、MM29kDの作用過程においてCD7の役割を明らかにする為、CD7cDNA作成を行うと共に、Jurkat細胞表面へのMM29kDの結合によって標的細胞内に惹起される事象を調査した。CD7cDNAは、ORFの作製が完了し、発現ベクターの構築を試みているところである。今後CD7cDNAを、MM29kD非感受性細胞であるHEK293に導入発現させ、MM29kD感受性の変動を究明する必要が有る。
MM29kD投与によって標的細胞Jurkatがアポトーシスによる細胞死に至る事が強く示唆されている。この際、ミトコンドリアの膜損傷が認められるのでMM29kD刺激により誘導される標的細胞Jurkatの細胞内応答を調査した。MM29kD処理をしたJurkat細胞の全蛋白質を二次元ゲル電気泳動で解析し、low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMW-PTP)が変動することを突き止めた。さらにLMW-PTP活性がMM29kD処理によって低下する事、そしてこれがMM29kD処理によって産生誘導された活性酸素種(ROS)によることが認められた。これらのことから、MM29kDの作用でJurkat細胞内に産生したROSによってミトコンドリア膜が損傷を受け、チトクロムcが細胞質に漏出する結果アポトーシスによる細胞死が誘導されるのではないかと考えられる。
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