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2005 年度 実績報告書

低分子リガンド標的蛋白質の超高選択的解析法

研究課題

研究課題/領域番号 17590029
研究機関東北大学

研究代表者

眞野 成康  東北大学, 大学院・薬学研究科, 助教授 (50323035)

キーワードタンパク質相互作用 / アフィニティー抽出 / プロテオミクス / ジスルフィドリンカー / 質量分析法 / シグナル伝達 / タンパク質立体構造 / モノクローナル抗体
研究概要

比較的低分子量の物質が開始シグナルとなるタンパク質相互作用ネットワークパスウェイを解析するうえで、そのトリガーとなる小分子-タンパク質相互作用の解析はきわめて重要である。しかしながら、これまで汎用されてきたアフィニティー抽出法は、ゲル表面やリンカー部分への非特異的吸着がしばしば問題となってきた。そこで今回、リンカー部分にジスルフィド結合を導入したcleavable affinity gelを新たに調製し、生体内小分子結合タンパク質の特異的抽出法の構築を試みた。
まず、ゲル末端を活性エステル化したアガロースゲルに対しシスタミンを作用させ、ゲルにジスルフィドリンカーを導入した。次いで、モデル化合物として用いたデオキシコール酸のp-ニトロフェニルエステルと混合し、リガンド分子をゲルに固定化した。調製したゲルに対して還元剤を作用させてジスルフィドリンカーの切断効率を調べたところ、リガンド分子に対して2.5当量のジチオスレイトールを用いて1時間インキュベートすると、ジスルフィドリンカーを完全に切断できることが判明した。一方、本還元反応による抽出タンパク質の立体構造への影響を精査するため、モデルタンパク質として血清アルブミンを用いてタンパク質分子内のジスルフィド結合の切断につき解析した。その結果、タンパク質分子に対して10当量までのジチオスレイトールを用いても分子内部のジスルフィド結合は影響されず、20当量以上で3次構造の崩壊が起こることが明らかとなった。引き続き、本アフィニティーゲルを抗デオキシコール酸抗体を含むマウス腹水と混合し、洗浄後、2.5当量のジチオスレイトールを用いて結合タンパク質を回収した後、SDS-PAGEにより抽出タンパク質を解析した。その結果、3つのタンパク質バンドのみが検出され、それらをゲル内消化後、質量分析法により解析したところ、血清アルブミン及び抗デオキシコール酸抗体の重鎖、軽鎖であることが明らかとなった。ちなみに非還元条件下でnative-PAGEに付したところ、抗体の分子内ジスルフィド結合は維持されていることが判明した。

  • 研究成果

    (12件)

すべて 2006 2005

すべて 雑誌論文 (12件)

  • [雑誌論文] High sensitive analysis of rat serum bile acids by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry2006

    • 著者名/発表者名
      Masayuki Ando
    • 雑誌名

      Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40

      ページ: 1179-1186

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [雑誌論文] Development of a large-volume, membrane-based injection system for gradient elution micro-liquid chromatography2006

    • 著者名/発表者名
      Kaoru Murata
    • 雑誌名

      Journal of Chromatography A 1106

      ページ: 146-151

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [雑誌論文] Immunoaffinity extraction of a peptide modified by a small molecule2006

    • 著者名/発表者名
      Nariyasu Mano
    • 雑誌名

      Analytical Biochemistry 349

      ページ: 254-261

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [雑誌論文] Ionization of unconjugated, glycine-and taurine-conjugated bile acids by electrospray ionization mass spectrometry2006

    • 著者名/発表者名
      Nariyasu Mano
    • 雑誌名

      Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40

      ページ: 1231-1234

  • [雑誌論文] Nuclear magnetic resonance spectroscopy of 3β,7β-dihydroxy-5-cholen-24-oic acid multi-conjugates : Unusual bile acid metabolites in human urine2006

    • 著者名/発表者名
      Genta Kakiyama
    • 雑誌名

      Chemical Physics of Lipids (in press)

  • [雑誌論文] Immunoenzymometric assay for a small molecule, 11-deoxycortisol, with attomole-range sensitivity employing an scFv-enzyme fusion protein and anti-idiotype antibodies2006

    • 著者名/発表者名
      Norihiro Kobayashi
    • 雑誌名

      Analytical Chemistry (in press)

  • [雑誌論文] Transport of fluorescent chenodeoxycholic acid via the human organic anion transporters OATO1B1 and OATP1B32006

    • 著者名/発表者名
      Hiroaki Yamaguchi
    • 雑誌名

      Journal of Lipid Research (in press)

  • [雑誌論文] Generation of a single-chain Fv fragment for the monitoring of deoxycholic acid residues anchored on endogenous proteins2005

    • 著者名/発表者名
      Norihiro Kobayashi
    • 雑誌名

      Steroids 70

      ページ: 285-294

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [雑誌論文] Identification of a novel conjugate in human urine : Bile acid acyl galactosides2005

    • 著者名/発表者名
      Takaaki Goto
    • 雑誌名

      Steroids 70

      ページ: 185-192

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [雑誌論文] Formation of DNA adducts with cholyl adenylate, a putative intermediate for biosynthesis of cholyl-CoA2005

    • 著者名/発表者名
      Takeji Takamura-Enya
    • 雑誌名

      Chemical Research in Toxicology 18

      ページ: 1715-1720

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [雑誌論文] Chemical synthesis of 24-β-D-galactopyranosides of bile acids : a new type of bile acid conjugates in human urine2005

    • 著者名/発表者名
      Genta Kakiyama
    • 雑誌名

      Chemical Physics of Lipids 134

      ページ: 141-150

  • [雑誌論文] Chemical synthesis of the 3-Sulfooxy-7-N-acetylglucosaminyl-24-amidated conjugates of 3β,7β-dihydroxy-5-cholen-24-oic acid, and related compounds : Unusual, major metabolites of bile acid in a patient with Niemann-Pick disease type C12005

    • 著者名/発表者名
      Takashi Iida
    • 雑誌名

      Steroids 71

      ページ: 18-29

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公開日: 2007-04-02   更新日: 2016-04-21  

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