低分子リガンド標的蛋白質の超高選択的解析法

2006 年度 研究成果報告書概要

• 研究課題/領域番号: 17590029
• 研究種目: 基盤研究(C)
• 配分区分: 補助金
• 応募区分: 一般
• 研究分野: 物理系薬学
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 眞野 成康 東北大学, 大学院薬学研究科, 助教授 (50323035)
• 研究期間 (年度): 2005 – 2006
• キーワード: タンパク質相互作用 / アフィニティー抽出 / プロテオミクス / cleavable affinity gel / 質量分析法 / ジスルフィドリンカー / 成長ホルモン / 小分子-タンパク質相互作用

研究概要

比較的分子量の小さい分子の結合が開始シグナルとなるタンパク質相互作用ネットワークパスウェイの解析には、まず小分子-タンパク質間の相互作用を解析することが不可欠となる。しかしながら、従来のアフィニティー抽出法では非特異的吸着がしばしば問題となっていたことから、今回、リンカー部分にジスルフィド結合を導入したcleavable affinity gelを開発し、小分子結合タンパク質の特異的抽出法の構築を試みた。
活性エステル化したアガロースゲルにシスタミンを作用させてジスルフィドリンカーを導入した後、デオキシコール酸(DCA)を固定化した。ジスルフィドリンカーの還元的切断条件を検討し、さらに切断反応時のタンパク質立体構造への影響を精査した後、抗DCA抗体を含むマウス腹水中の結合タンパク質の抽出を試みた。SDS-PAGEによる分離後、質量分析法により解析した結果、血清アルブミン及び抗DCA抗体のH鎖、L鎖が濃縮されたことが判った。
次に、ラット脳内の胆汁酸結合タンパク質の解析を試みた。Wistar系雄性ラット脳を大脳、中脳、小脳、脳幹、海馬及び下垂体に分けた後、可溶性画分を調製した。ケノデオキシコール酸(CDCA)を固定化したcleavable affinity gelを用いて結合タンパク質を抽出した後、SDS-PAGEに付した。その結果、共通して3種のタンパク質バンドが濃縮され、それらはa-、β-チューブリン、β-アクチン及び14-3-3タンパク質であることが判明した。さらに下垂体試料から他に2種のバンドが認められ、それぞれ血清アルブミン及び成長ホルモンであることが明らかとなった。血清アルブミンは胆汁酸のキャリアータンパク質であり、下垂体門脈血から抽出されたものと思われるが、これが特異的に抽出されたことを考え合わせると、CDCAがこれらタンパク質と脳内で結合することが強く示唆された。

研究成果

• [雑誌論文] LC/ESI-tandem mass spectrometric determination of bile acid 3-sulfates in human urine. 3β-Sulfooxy-12α-hydroxy-5β-cholanoic acid is an abundant nonamidated sulfate (2007)
  • 著者名/発表者名: Takaaki Goto
  • 雑誌名: Journal of Chromatography B 846 ページ: 69-77
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Regioselective oxyfunctionalization of unactivated carbons in steroids by a model of cytochrome P-450 : Osmiumporphyrin complex/tert-butyl hydroperoxide system (2007)
  • 著者名/発表者名: Takashi Iida
  • 雑誌名: Journal of Organic Chemistry 72 ページ: 823-830
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] LC/ESI-tandem mass spectrometric determination of bile acid 3-sulfates in human urine. 3β-Sulfooxy-12α-hydroxy-5β-cholanoic acid is an abundant nonamidated sulfate. (2007)
  • 著者名/発表者名: Takaaki Goto, Khin Than Myint, Koichi Sato, Osamu Wada, Genta Kakiyama, Takashi Iida, Takanori Hishinuma, Nariyasu Mano, Junichi Goto
  • 雑誌名: J. Chromatogr. B 846 ページ: 69-77
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Regioselective oxyfunctionalization of unactivated carbons in steroids by a model of cytochrome P-450 : Osmiumporphyrin complex/tert-butyl hydroperoxide system. (2007)
  • 著者名/発表者名: Takashi Iida, Shoujiro Ogawa, Keiji Hosoi, Mitsuko Makino, Yasuo Fujimoto, Takaaki Goto, Nariyasu Mano, Junichi Goto, Alan F. Hofmann
  • 雑誌名: J. Org. Chem. 72 ページ: 823-830
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Chemical synthesis of the 3-sulfooxy-7-N-acetylglucosaminyl-24-amidated conjugates of 3β, 7β-dihydroxy-5-cholen-24-oic acid, and related compounds : Unusual, major metabolites of bile acid in a patient with Niemann-Pick disease type C1 (2006)
  • 著者名/発表者名: Takashi Iida
  • 雑誌名: Steroids 71 ページ: 18-29
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] High sensitive analysis of rat serum bile acids by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry (2006)
  • 著者名/発表者名: Masayuki Ando
  • 雑誌名: Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40 ページ: 1179-1186
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Ionization of unconjugated, glycine- and taurine-conjugated bile acids by electrospray ionization mass spectrometry (2006)
  • 著者名/発表者名: Nariyasu Mano
  • 雑誌名: Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 40 ページ: 1231-1234
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Development of a large-volume, membrane-based injection system for gradient elution micro-liquid chromatography (2006)
  • 著者名/発表者名: Kaoru Murata
  • 雑誌名: Journal of Chromatography A 1106 ページ: 146-151
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Nuclear magnetic resonance spectroscopy of 3β, 7β-dihydroxy-5-cholen-24-oic acid multi-conjugates : unusual bile acid metabolites in human urine (2006)
  • 著者名/発表者名: Genta Kakiyama
  • 雑誌名: Chemistry and Physics of Lipids 140 ページ: 48-54
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Immunoaffinity extraction of a peptide modified by a small molecule (2006)
  • 著者名/発表者名: Nariyasu Mano
  • 雑誌名: Analytical Biochemistry 349 ページ: 254-261
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Immunoenzymometric assay for a small molecule, 11-deoxycortisol, with attomole-range sensitivity employing an scFv-enzyme fusion protein and anti-idiotype antibodies (2006)
  • 著者名/発表者名: Norihiro Kobayashi
  • 雑誌名: Analytical Chemistry 78 ページ: 2244-2253
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Transport of fluorescent chenodeoxycholic acid via the human organic anion transporters OATP1B1 and OATP1B3 (2006)
  • 著者名/発表者名: Hiroaki Yamaguchi
  • 雑誌名: Journal of Lipid Research 47 ページ: 1196-1202
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] A direct method for the separation and quantification of bile acid acyl glycosides by high-performance liquid chromatography with an evaporative light scattering detector (2006)
  • 著者名/発表者名: Genta Kakiyama
  • 雑誌名: Journal of Chromatography A 1125 ページ: 112-116
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Analysis of the modification site in a small molecule-modified peptide by ion trap/time-of-flight hybrid mass spectrometry (2006)
  • 著者名/発表者名: Nariyasu Mano
  • 雑誌名: Analytical and Bioanalytical Chemistry 386 ページ: 682-688
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Specific affinity extraction method for small molecule-binding proteins (2006)
  • 著者名/発表者名: Nariyasu Mano
  • 雑誌名: Analytical Chemistry 78 ページ: 4668-4675
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Simplified gradient generator for micro- and nano-liquid chromatography (2006)
  • 著者名/発表者名: Kaoru Murata
  • 雑誌名: Journal of Chromatography A 1123 ページ: 47-52
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Identification of a novel bile acid in swans, tree ducks, and geese : 3α, 7α, 15α-trihydroxy-5β-cholan-24-oic acid (2006)
  • 著者名/発表者名: Genta Kakiyama
  • 雑誌名: Journal of Lipid Research 47 ページ: 1551-1558
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] AMSH, an ESCRT-III associated enzyme, deubiquitinates cargo on MVB/Late endosomes (2006)
  • 著者名/発表者名: Masanao Kyuuma
  • 雑誌名: Cell Structure and Function 31 ページ: 159-172
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Chemical synthesis of the 3-sulfooxy-7-N-acetylglucosaminy1-24-amidated conjugates of 3β,7β-dihydroxy-5-cholen-24-oic acid, and related compounds : Unusual, major metabolites of bile acid in a patient with Niemann-Pick disease type Cl. (2006)
  • 著者名/発表者名: Takashi Iida, Genta Kakiyama, Yohei Hibiya, Shohei Miyata, Takehiko Inoue, Kohsaku Ohno, Takaaki Goto, Nariyasu Mano, Junichi Goto, Toshio Nambara, Alan F. Hofmann
  • 雑誌名: Steroids 71 ページ: 18-29
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] High sensitive analysis of rat serum bile acids by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry. (2006)
  • 著者名/発表者名: Masayuki Ando, Tohru Kaneko, Ritsuko Watanabe, Satoshi Kikuchi, Takaaki Goto, Takashi Iida, Takanori Hishinuma, Nariyasu Mano, Junichi Goto
  • 雑誌名: J. Pharm. Biomed. Anal. 40 ページ: 1179-1186
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Ionization of unconjugated, glycine-and taurine-conjugated bile acids by electrospray ionization mass Spectrometry. (2006)
  • 著者名/発表者名: Nariyasu Mano, Masaru Mori, Masayuki Ando, Takaaki Goto, Junichi Goto
  • 雑誌名: J. Pharm. Biomed. Anal. 40 ページ: 1231-1234
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Development of a large-volume, membrane-based injection system for gradient elution micro-liquid chromatography. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kaoru Murata, Nariyasu Mano, Naoki Asakawa
  • 雑誌名: J. Chromatogr. A 1106 ページ: 146-151
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Nuclear magnetic resonance spectroscopy of 3β,7β-dihydroxy-5-cholen-24-oic acid multi-conjugates : unusual bile acid metabolites in human urine. (2006)
  • 著者名/発表者名: Genta Kakiyama, Shoujiro Ogawa, Takashi Iida, Yasuo Fujimoto, Kumiko Mushiake, Takaaki Goto, Nariyasu Mano, Junichi Goto, Toshio Nambara
  • 雑誌名: Chem. Phys. Lipids 140 ページ: 48-54
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Immunoaffinity extraction of a peptide modified by a small molecule. (2006)
  • 著者名/発表者名: Nariyasu Mano, Kohei Abe, Junichi Goto
  • 雑誌名: Anal. Biochem. 349 ページ: 254-261
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Immunoenzymometric assay for a small molecule, 11-deoxycortisol, with attomole-range sensitivity employing an scFv-enzyme fusion protein and anti-idiotype antibodies. (2006)
  • 著者名/発表者名: Norihiro Kobayashi, Keiichi Iwakami, Shuhei Kotoshiba, Toshifumi Niwa, Yoshinori Kato, Nariyasu Mano, Junichi Goto
  • 雑誌名: Anal. Chem. 78 ページ: 2244-2253
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Transport of fluorescent chenodeoxycholic acid via the human organic anion transporters OATP1B1 and OATP1B3. (2006)
  • 著者名/発表者名: Hiroaki Yamaguchi, Masahiro Okada, Shou Akitaya, Hiroshi Ohara, Tsuyoshi Mikkaichi, Haruna Ishikawa, Mayumi Sato, Masaki Matsuura, Toshihide Saga, Michiaki Unno, Takaaki Abe, Nariyasu Mano, Takanori Hishinuma, Junichi Goto
  • 雑誌名: J. Lipid Res. 47 ページ: 1196-1202
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] A direct method for the separation and quantification of bile acid acyl glycosides by high-performance liquid chromatography with an evaporative light scattering detector. (2006)
  • 著者名/発表者名: Genta Kakiyama, Atsuko Hosoda, Takashi Iida, Yasuo Fujimoto, Takaaki Goto, Nariyasu Mano, Junichi Goto, Toshio Nambara
  • 雑誌名: J. Chromatogr. A 1125 ページ: 112-116
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Analysis of the modification site in a small molecule-modified peptide by ion trap/time-of-flight hybrid mass spectrometry. (2006)
  • 著者名/発表者名: Nariyasu Mano, Mio Kamota, Yusuke Inohara, Shin-ichi Yamaguchi, Junichi Goto
  • 雑誌名: Anal. Bioanal. Chem. 386 ページ: 682-688
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Specific affinity extraction method for small molecule-binding proteins. (2006)
  • 著者名/発表者名: Nariyasu Mano, Koichi Sato, Junichi Goto
  • 雑誌名: Anal. Chem. 78 ページ: 4668-4675
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Simplified gradient generator for micro-and nano-liquid chromatography. (2006)
  • 著者名/発表者名: Kaoru Murata, Nariyasu Mano, Naoki Asakawa, Yasushi Ishihama
  • 雑誌名: J. Chromatogr. A 1123 ページ: 47-52
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Identification of a novel bile acid in swans, tree ducks, and geese : 3α,7α,15α-trihydroxy-5β-cholan-24-oic acid. (2006)
  • 著者名/発表者名: Genta Kakiyama, Takashi Iida, Takaaki Goto, Nariyasu Mano, Junichi Goto, Toshio Nambara, Lee R. Hagey, Alan F. Hofmann
  • 雑誌名: J. Lipid Res. 47 ページ: 1551-1558
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] AMSH, an ESCRT-III associated enzyme, deubiquitinates cargo on MVB/Late endosomes. (2006)
  • 著者名/発表者名: Masanao Kyuuma, Kazu Kikuchi, Katsuhiko Kojima, Yuriko Sugawara, Mariko Sato, Nariyasu Mano, Junichi Goto, Toshikazu Takeshita, Akitsugu Yamamoto, Kazuo Sugamura, Nobuyuki Tanaka
  • 雑誌名: Cell Struct. Funct. 31 ページ: 159-172
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Generation of a single-chain Fv fragment for the monitoring of deoxycholic acid residues anchored on endogenous proteins (2005)
  • 著者名/発表者名: Norihiro Kobayashi
  • 雑誌名: Steroids 70 ページ: 285-294
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Identification of a novel conjugate in human urine : Bile acid acyl galactosides (2005)
  • 著者名/発表者名: Takaaki Goto
  • 雑誌名: Steroids 70 ページ: 185-192
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Chemical synthesis of 24-β-D-galactopyranosides of bile acids : a new type of bile acid conjugates in human urine (2005)
  • 著者名/発表者名: Genta Kakiyama
  • 雑誌名: Chemistry and Physics of Lipids 134 ページ: 141-150
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Formation of DNA adducts with cholyl adenylate, a putative intermediate for biosynthesis of cholyl-CoA (2005)
  • 著者名/発表者名: Takeji Takamura-Enya
  • 雑誌名: Chemical Research in Toxicology 18 ページ: 1715-1720
  • 説明: 「研究成果報告書概要(和文)」より
• [雑誌論文] Generation of a single-chain Fv fragment for the monitoring of deoxycholic acid residues anchored on endogenous proteins. (2005)
  • 著者名/発表者名: Norihiro Kobayashi, Mamoru Ohtoyo, Eriko Wada, Yoshinori Kato, Nariyasu Mano, Junichi Goto
  • 雑誌名: Steroids 70 ページ: 285-294
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Identification of a novel conjugate in human urine : Bile acid acyl galactosides (2005)
  • 著者名/発表者名: Takaaki Goto, Akihiro Shibata, Daisuke Sasaki, Naoto Suzuki, Takanori Hishinuma, Genta Kakiyama, Takashi Iida, Nariyasu Mano, Junichi Goto
  • 雑誌名: Steroids 70 ページ: 185-192
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Chemical synthesis of 24-β-D-galactopyranosides of bile acids : a new type of bile acid conjugates in human urine. (2005)
  • 著者名/発表者名: Genta Kakiyama, Shinji Sadakiyo, Takashi Iida, Kumiko Mushiake, Takaaki Goto, Nariyasu Mano, Junichi Goto, Toshio Nambara
  • 雑誌名: Chem. Phys. Lipids 134 ページ: 141-150
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より
• [雑誌論文] Formation of DNA adducts with cholyl adenylate, a putative intermediate for biosynthesis of cholyl-CoA. (2005)
  • 著者名/発表者名: Takeji Takamura-Enya, Nariyasu Mano, Nobuo Kawahara, Junichi Goto, Keiji Wakabayashi
  • 雑誌名: Chem. Res. Toxicol. 18 ページ: 1715-1720
  • 説明: 「研究成果報告書概要(欧文)」より