| 研究概要 |
我々は生物発光検出を利用した高感度イムノアッセイを検討してきた。生物発光法のうち、ホタルのルシフェリン-ルシフエラーゼ反応は良く知られており、ATP、Mg^<2+>、分子状酸素およびルシフェリン存在下で発光する。またオワンクラゲから単離されたイクオリンはカルシウムイオンと特異的に発光する。各々の発光反応は1〜3秒程度でピークが認められることから短時間での測定が可能である。これら二つの発光機構は全く異なることからイクオリンとビオチン化ルシフェラーゼの同時検出法を構築した。イクオリンの発光はカルシウム溶液添加後,1秒以内で最大値を示し瞬時消失した.一方,ビオチン化ルシフェラーゼの発光は基質添加後,約1秒で最大値を示し緩徐に減少した.従って次の様に二つの発光タンパク質の同時測定を行った.イクオリンとビオチン化ルシフェラーゼ溶液をマイクロタイタープレートの各ウェルにそれぞれ10μLずつ分注した。最初にカルシウム溶液100μLを加え、直後に1秒間の発光量を測定しイクオリンの活性を測定した。次に、ルシフェラーゼ基質液100μLを加えた2秒後の1秒間の発光量を測定し、ビオチン化ルシフェラーゼの活性を測定した。
本同時測定系におけるイクオリン及びビオチン化ルシフェラーゼの最小検出感度は各々9.4x10^<-21>mol/assay(blank+3SD)、3.6x10^<-19>mol/assay(blank+3SD)であり、単独測定と同等な結果が得られた。また日内同時再現性は2.3〜4.4%(CV%,n=8)、3.6〜5.8%(CV%,n=8)と良好であった。
次年度は本検出法を高感度2成分同時検出生物発光イムノアッセイに応用を行う.
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