| 研究概要 |
発光機構が全く異なる発光タンパク質イクオリンとビオチン化ルシフェラーゼの同時検出法を構築した,イクオリンとビオチン化ルシフェラーゼ溶液をプレートの各ウェルにそれぞれ10μLずっ分注し,最初にカルシウム溶液100μLを加え,直後に1秒間の発光量を測定しイクオリンの活性を測定した.次に,ルシフェラーゼ基質液100μLを加えた2秒後の1秒間の発光量を測定し,ビオチン化ルシフェラーゼの活性を測定した.本同時測定系におけるイクオリン及びビオチン化ルシフェラーゼの最小検出感度は各々9.4x10^<-21>mol/assay及び3.6x10^<-19>mol/assayであり,日内同時再現性は2.3〜4.4%(CV%,n=8),3.6〜5.8%(CV%,n=8)と良好であった.
さらに二つの発光タンパク質を標識に用いる二成分同時イムノアッセイを試みた.抗前立腺特異抗原(PSA)抗体と抗前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)抗体を固相化したプレートの各ウェルに,PSA, PAP標準溶液を各々10μL,ビオチン化抗PSA抗体溶液,ジゴキシゲニン化抗PAP抗体を各々50μL加え室温で2時間放置した.洗浄後,イクオリン標識抗ジゴキシゲニンFab抗体溶液,ストレプトアビジン-ビオチン化ルシフェラーゼ複合体溶液を各々50μL添加し室温で一時間反応させた.再洗浄後,上述の方法でイクオリン由来の発光とルシフェラーゼ由来の発光を測定した.なおPSAとα-フェトプロテイン(AFP)の二成分同時イムノアッセイも同様の方法で行った.PSAとPAPの二成分同時イムノアッセイでは,各々の最小検出感度は5.92x10^<-17>mol/assay(PSA),7.14x10^<-18>mol/assay(PAP)であった.PSAとAFPの二成分同時イムノアッセイでは,各々の最小検出感度は7.14x10^<-18>mol/assay(PSA),2.07x10^<-18>mol/assay(AFP)であった.これらの感度は血清試料を測定するのに適しており,得られた値は市販のキットの値と良く相関した.
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