| 研究概要 |
1.野生型ヒトCES1、CES2及びCES3のGateway Cloning
市販のヒト肝臓Total RNAを用いて、Gateway TOPO Cloning法によりCES1、CES2及びCES3をpENTR/D・TOPOベクターにCloningした。
2.哺乳動物細胞及び昆虫細胞による野生型CES1、CES2、CES3発現系の構築
pENTR/D-TOPOベクターにCloningした各CES分子種の野生型cDNAをGateway LR反応でpcDNA-DEST40にSubcloningし、得られたConstructsをHEK293細胞にTransfectionして一過性に発現させた。また、各cDNAをBaculoDirect C-term Linear DNAにSubcloningし、Sf21細胞にInfectionしてC-末His-タグ融合タンパク質として発現させ、Ni-NTA agaroseを用いて組換えタンパク質の精製を行った。
3.ピレスロイド系殺虫剤代謝物測定法の開発
I型ピレスロイド系殺虫剤・Permethrinの代謝物として生成する可能性のあるすべての化合物、すなわちcis/trans-3-(2,2-dichloro-vinyl)-2,2-dimethylcyclopropane carboxylic acid、3-phenoxybenzaldehyde、3-phenoxybenzoic acid及び3-phenoxybenzyl alcoholをHPLC/UVで定量する方法を確立し、CES1、CES2及びCES3の加水分解活性を測定する方法を開発した。
4.ピレスロイド系殺虫剤のCESによる代謝
2.で得た各CES分子種組換えタンパク質を用いて、cis-及びtrans-permethrinの加水分解反応を速度論的に解析し、Kinetic Parametersを明らかにした。
本研究によって、CES1及びCES2がPermethrinの代謝に重要な役割を果たすことが示された。以上の結果は、フォーラム2005:衛生薬学・環境トキシコロジー(2005年10月)にて発表、及び日本薬学会第126年会(2006年3月)にて発表予定である。
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