研究課題
基盤研究(C)
Rhod-2をラット単離心室筋細胞に負荷後し、サポニンにより細胞膜をpermeabilizeし細胞質内のRhod-2を流出させることで、ミトコンドリア内Caを選択的に計測することが可能となった。サポニン処理後、0Na, 300nM Caの液を潅流するとRhod-2蛍光は増加し定常状態に達した。このCa増加はミトコンドリアCa uniporter阻害剤(ruthenium red)で阻害されたので、Ca uniporterが主たるCa流入経路であると考えられた。外液を0Ca, 6mM Naに交換するとRhod-2蛍光は減少した。細胞質Na非存在下には、Rhod-2蛍光はほぼ一定に保たれることから、ミトコンドリアCaの排出の主たるメカニズムはNa/Ca交換(mNCX)であることが示された。mNCXのNaに対する半飽和濃度は約1mMであった。心筋ミトコンドリアmNCXはミトコンドリア内膜電位に依存すると考えられてきた。しかし、上記のmNCX活性化プロトコールを、TMRE(膜電位感受性色素)を負荷した心室筋細胞において実施したところ、内膜電位はほとんど変化しなかった。このことは、mNCXは起電性がほとんど無いことを示唆する。また、NS1619(BKチャネル開口薬)、FCCP(Hイオノフォア)、またはミトコンドリア基質(ピルビン酸、コハク酸等)除去によりミトコンドリア膜電位を脱分極させたときのmNCXを介するCa排出速度は、膜電位が維持されている時と比べて有意な差は無かった。これらの実験データは、心室筋細胞mNCXの膜電位依存性はほとんど無いことを示す。上記、実験データをもとにミトコンドリアCa動態を再構築するコンピュータモデルを作成した。シミュレーション解析の結果、ミトコンドリアCaは、ホスト心筋細胞の収縮頻度依存性に変化し、ミトコンドリア脱水素酵素を活性化することでNADH産生を増加させることが明らかになった。また、実験で観察された細胞収縮頻度依存性のNADH蛍光変化は、心筋細胞のATP消費の増加に伴うADPと無機リン酸が増加(feed back control)と遅延性ミトコンドリアCa増加による脱水素酵素活性化により引き起こされることが明らかになった。
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