|
シナプス前終末における神経分泌における開口放出や分泌小胞輸送、リサイクリング過程には、酵母から哺乳動物まで広く進化上保存されたSNARE連関タンパク質群が必須であると考えられている。近年、開口放出の際、融合細孔の形成には、SNAREコア複合体の形成が必須であると考えられている(SNARE仮説)。しかし、この分子複合体がどのように膜融合を引き起こすのか、その作用機序や生理的機能は未解明である。この問題の解決には生理的な環境下でSNARE複合体形成と融合細孔形成の因果関係や作用機序を解析し、明確化することが必須である。本研究では、申請者の確立してきた2光子励起法を発展させ、神経分泌のモデル細胞として一般的なPC12細胞に蛍光タグ化タンパク質を発現させ、Ca^<2+>濃度上昇、SNAREコア複合体の形成、融合細孔形成の間の時間的空間的な因果関係を定量的に明らかにすることを目的として実施した。本年度は、まずPC12細胞に、SNAREコア複合体の構成分子である蛍光タグ化SNAP25発現系を確立し、PC12細胞に導入した。蛍光抗体染色法により、内在性のSNAP25同様に細胞膜に集積することが判った。さらに、ケージドカルシウム試薬(NP-EGTA-AM体)を負荷させたPC12標本を、水溶性の近赤外蛍光化デキストランを含む細胞外液で灌流することで、細胞外部空間をネガティブに染色し、NP-EGTAの紫外線閃光活性化による開口放出の際生じるΩ構造と蛍光タグ化SNAP25を同時を可視化する系を確立した。その結果、逐次開口放出という新規的な様式で分泌が生じていることに加え、SNAP25の、融合した顆粒膜への側方拡散が観察された。細胞深部へSNAP25が拡散し、SNARE複合体を深部分泌顆粒膜上で形成することが、効率的な分泌顆粒の分泌への動員に重要であることが推定された。
|
