| 研究課題/領域番号 |
17590212
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| 研究機関 | 群馬大学 |
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研究代表者 |
中村 彰男 群馬大学, 大学院医学系研究科, 講師 (30282388)
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| 研究分担者 |
石川 良樹 群馬大学, 大学院医学系研究科, 講師 (20212863)
小浜 一弘 群馬大学, 大学院医学系研究科, 教授 (30101116)
岸 博子 山口大学, 大学院医学系研究科, 講師 (40359899)
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| キーワード | 平滑筋収縮 / MLCK / ミオシン / アクチン / リコンビナント / 大腸菌発現系 / プロテインキナーゼ / リン酸化 |
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| 研究概要 |
本研究では平滑筋の持続的収縮(ラッチ収縮)の制御に的を絞ってその責任蛋白質をミオシン軽鎖キナーゼ(MLCK)、しかもそれの持つnon-kinase作用にあると考え、その上流にある情報伝達系蛋白質を網羅的に検索するプロジェクトを遂行した。平滑筋MLCKは様々なプロテインキナーゼによりリン酸化されることが知られている。そこで牛の胃の平滑筋から精製したMLCKを用いて、リン化蛋白質を特異的に染色するProQ Diamond蛍光染色剤により染色すると、MLCKは染色され、既に部分的にリン酸化を受けていることを発見した。MLCKがどの様なプロテインキナーゼによりリン酸化されるかを調べるために、翻訳後修飾を受けていない大腸菌の発現系を用いて発現したリコンビナントMLCKを基質にして、8種類の平滑筋で機能しているセリン・スレオニンキナーゼを使ってリン酸化実験を行った。その結果、Rhoキナーゼ、Aキナーゼ、Cキナーゼ、PAKおよびMAPキナーゼの5種類のキナーゼでリン酸化されることがわかった。さらに、それらのリン酸化部位を決定するためにタンデム型質量分析計(ABI400QTrap)を用いてMS/MS解析を行った。その結果、Rhoキナーゼでは3カ所、Aキナーゼでは2カ所、Cキナーゼでは1カ所、PAKでは2カ所、MAPキナーゼでは1カ所のリン酸化される部位を決定することが出来た。このうち、AキナーゼとPAKは既にリン酸化部位が報告されており、今回の決定した部位とそれらは完全に一致した。牛の胃の平滑筋より単離・精製したMLCKを上記と同様に調べてみるとその中にはチロシンキナーゼによるリン酸化部位も見つかった。これらMLCKの上流域でのシグナル伝達が明らかになることにより、平滑筋の新たな収縮機構に関わる分子メカニズムを詳細に解明する途が開けた。
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