過剰産生タンパク質のユビキチン化と誘導性小胞体膜構造物による囲い込み

2005 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 17590244
• 研究機関: 浜松医科大学
• 研究代表者: 小田 敏明 浜松医科大学, 医学部, 助教授 (90126805)
• 研究分担者: 北川 雅敏 浜松医科大学, 医学部, 教授 (50294971) ; 内田 千晴 浜松医科大学, 医学部, 助手 (60223567)
• キーワード: タンパク質過剰産生ストレス / クリスタロイド小胞体 / タンパク質の質と量の制御 / ユビキチン化

研究概要

小胞体(ER)をリアルタイムに可視化するレポータータンパクとしてER内腔局在性の蛍光タンパク質発現クローン(pEF/myc/ER/EYFP)を使用し、クリスタロイド小胞体(cER)形成細胞などをカウントすることにより、cER形成能を定量的に評価することができた。過剰発現によりcER形成が誘導されることを確認している、アルデヒド脱水素酵素(ALDH)、ミトコンドリア(Mt)局在型セリン:ピルビン酸アミノ転移酵素前駆体(SPT45K)以外に他のMtマトリックス移行前駆体タンパク質(pOTC,pAd)も過剰発現によりER凝集物(おそらくcER)形成を誘導することが明らかとなった。また、ALDHのER局在化配列をEYFPのC末に連結したキメラタンパク質,EYFP-C(ALDH)はこれまでにはない非常に強力なER凝集物誘導能を有することが明らかとなった。本研究でER膜タンパク質ではないMt移行前駆体タンパク質もER凝集物形成能があることが複数の例で示された。
免疫電顕によると、cER上に濃縮されたユビキチン(Ub)シグナルが検出されるが、これが過剰発現されたタンパク質自身に付加されたUbによるものかどうかを調べた。外来性のUbの共発現でALDHでは確かにタンパク質自身に付加したと思われるUbスメアーが検出されたが、SPT45Kではスメアーは検出されなかった。産物のUb化とcER形成が直接、関連しているかどうかは今のところ不明である。
ER内腔でのタンパク質の過剰発現では「変性タンパク質応答(UPR)」などの一連の細胞応答が引き起こされることが知られている。本研究では細胞質におけるタンパク質の過剰発現の効果を調べようとしており、その発現場所が異なっている。実際、cERを誘導する条件ではUPRは作動していないことがルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイ系で確かめられた。また、「ヒートショック応答」も作動していないという結果であった。cERの形成は従来考えられてきた「ER膜タンパク質の過剰発現による人工産物」というよりも、もっと積極な生理的意味を持つもの(たとえば、変性しやすいタンパク質の過剰蓄積による細胞毒性の緩和など)ではないかと考えられた。

研究成果

• [雑誌論文] Mdm2-mediated pRB downregulation is involved in carcinogenesis in a p53-independent manner. (2006)
  • 著者名/発表者名: Miwa, S., Uchida, C., Kitagawa, K., Hattori, T., Oda, T., Sugimura, H., Yasuda, H., Nakamura, H., Chida K., Kitagawa, M.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 340 ページ: 54-61
• [雑誌論文] Ubiquitin-dependent degradation of adenovirus E1A protein is inhibited by BS69. (2006)
  • 著者名/発表者名: Isobe, T., Uchida, C., Hattori, T., Kitagawa, K., Oda, T., Kitagawa, M.
  • 雑誌名: Biochem Biophys Res Commun. 339 ページ: 367-374
• [雑誌論文] Transcriptional induction of Smurf2 ubiquitin ligase by TGF-b. (2005)
  • 著者名/発表者名: Ohashi, N., Yamamoto, T., Uchida, C., Togawa, A., Fukasawa, H., Fujigaki, Y., Suzuki, S., Kitagawa, K., Hattori, T., Oda, T., Hayashi, H., Hishida, A., Kitagawa, M
  • 雑誌名: FEBS Letters 579 ページ: 2557-2563
• [雑誌論文] Enhanced Mdm2 activity ibhibits pRB function via ubiquitin-dependent degradation. (2005)
  • 著者名/発表者名: Uchida C., Miwa S., Kitagawa K., Hattori T., Isobe T., Otani S., Oda T., Sugimura H., Kamijo T., Ookawa K., Yasuda H., Kitagawa M.
  • 雑誌名: EMBO J. 24 ページ: 160-169
• [雑誌論文] Ubiquitin-dependent degradation of SnoN and Ski is increased in renal fibrosis induced by obstructive injury.
  • 著者名/発表者名: Fukasawa, H., Yamamoto, T., Togawa, A., Ohashi, N., Fujigaki, Y., Oda, T., Uchida, C., Kitagawa, K., Hattori, T., Suzuki, S., Kitagawa, M., Hishida, A
  • 雑誌名: Kidney Int. (in press)