| 研究概要 |
哺乳類精巣および脳に特異的に発現している硫酸化糖脂質セミノリピドを欠失しているマウスでは,精子形成が第一減数分裂を完了する前に停止していることが明らかとなっている。本研究では男性不妊症の原因の9割を占める精子形成不全のメカニズムを解明することを目的として,プロテオミクスからのアプローチにより,「セミノリピドが欠損するとなぜ精子形成が停止するのか?」という命題の解明を目指している。今年度は方法の確立に重点を置いて条件検討を行い,適切な分析条件を確立することができた。
1.マウスの飼育と試料の採取:CGTおよびCST遺伝子ノックアウトマウスを第一ウェーブの日齢ごとに集めてGenotypeを分析し,野生型,ホモ接合体に分けて精巣を採取した。
2.遺伝子の発現解析:マウス精巣における発生段階特異的な遺伝子発現パターンを,Gene Chipを用いて解析し,発現量が異なる遺伝子を複数見出した。今後,タンパク質発現パターンとの相関を調べる予定である。
3.精巣からのタンパク質の抽出:プロテオリシスや脱リン酸化が極力起こらない条件下で試料からタンパク質を十分に抽出する方法を確立し,二次元電気泳動に供するための適切な前処理法を確立した。
4.二次元電気泳動による分離と定量:pHレンジ,ゲル濃度などの泳動条件を確立し,タンパク質を1枚のゲル上のそれぞれ単一スポットに分離することができた。
5.日齢および遺伝子型によるプロテオームの比較:ゲルを蛍光色素で染色しプロテオームを比較したが,特異的に発現あるいは欠失しているタンパク質を見出すことはできなかった。今後はアポトーシスやシグナル伝達に関連する抗体による染色などを用いて,精子形成停止に至る分子メカニズムの解明を進める予定である。
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