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高等動物培養細胞株を用いて、単一の染色体部位にDNA二重鎖切断(DSB)を誘導し、その後の修復過程をリアルタイムモニタリングするシステムを構築することを目指して検討を続行中である。特異的配列を認識してDNAを切断する制限酵素を、認識配列を含んだ人工基質をあらかじめ染色体に1コピー組み込んだ細胞に導入する。導入法として、(1)18塩基認識制限酵素I-SceIに細胞内移行シグナルの11アミノ酸(TAT配列)を付加した組み換え蛋白を作製する。培養液に添加することで細胞内導入が高効率に期待できる。また、(2)エストロジェン受容体との癒合蛋白として発現させ、タモキシフェン添加によって一気に核内に移行させる。
I-SceI制限酵素とTAT配列との融合蛋白(TAT-I-SceI)、の精製条件の最適化を引き続き行っている。
I-SceIとERとの融合蛋白(ER-I-SceI-ER、ふたつのエストロジェン結合ドメインでI-SceIをはさんでいる)を発現させ、DSB誘導をligation mediated PCRで確認した。しかし、サザンブロットでは確認できない。リンカー部分をのばして検討中である。
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