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2005 年度 実績報告書

安定した遺伝子発現の得られるヒト人工染色体の開発と応用

研究課題

研究課題/領域番号 17590289
研究機関琉球大学

研究代表者

要 匡  琉球大学, 医学部, 助教授 (40264288)

研究分担者 成富 研二  琉球大学, 医学部, 教授 (20101446)
柳 久美子  琉球大学, 医学部, 助手 (90294701)
キーワード遺伝子 / 発現制御 / ミニ染色体 / 遺伝子治療 / DT40 / Cre / loxP
研究概要

<多様なミニ染色体ベクターの作製>
ミニ染色体上の部位(テロメア側、セントロメア内、中間領域)における遺伝子発現の影響および染色体の安定性を検討するため、それぞれの領域にゲノム遺伝子(BAC)を導入できるミニ染色体を個別に作製した。ミニ染色体の改変は、DT40細胞内で行った。
1)ミニ染色体改変用プラスミドベクターの構築
ミニ染色体へのBAC導入はCre/変異lox系を利用しているが、ヒトX染色体由来ミニ染色体(IaA1)へ、相同組換えにより変異型lox71を導入するためのプラスミドベクターを作製した。変異型lox71挿入用ベクターは、以前より使用しているblasticidinR発現カセット(CAG lox71bsr)にセントロメア配列(アルフォイドX配列)、またはZXDA遺伝子上流非アルフォイド配列を相同部分として組込み、作製した。また、ミニ染色体へ導入するBACはneoR遺伝子を含んでいるので、ミニ染色体テロメア側の薬剤耐性遺伝子をneoR遺伝子以外(ZeocinR遺伝子)へ変更するためのtelomere targeting vectorも新たに作製した。
2)ミニ染色体の改変
上記相同組換え用ベクターを用い、ミニ染色体の各部位へCAG lox71bsrをそれぞれ挿入した改変ミニ染色体を作製した。同時に、テロメア側(短腕側)をtelomere targeting vectorを用いてZeocinR遺伝子へ変更した。
3)改変ミニ染色体へのBAC導入
上記改変ミニ染色体へ、遺伝子発現ユニットをもつBAC(HPRT-66,F9-66)をCre/変異lox系を用いて導入した。導入効率は、約70%であった。PCR, FISH, PFGEにて完全かつ正確な導入を確認した。
<BAC導入ミニ染色体における遺伝子発現と安定性>
HPRT遺伝子は、いずれのミニ染色体においても発現が認められた(RT-PCR)。定量PCR(real time PCR)による発現比較、長期培養による発現変化の有無、染色体安定性の検討を行う予定である。

  • 研究成果

    (5件)

すべて 2006 2005

すべて 雑誌論文 (5件)

  • [雑誌論文] Germline KRAS and BRAF mutations in cardio-facio-cutaneous (CFC) syndrome.2006

    • 著者名/発表者名
      Niihori et al.
    • 雑誌名

      Nature Genetics 38

      ページ: 294-296

    • 説明
      「研究成果報告書概要(和文)」より
  • [雑誌論文] No detectable genomic aberrations by BAG array CGH in Kabuki make-up syndrome patients.2006

    • 著者名/発表者名
      Miyake et al.
    • 雑誌名

      American Journal of Medical Genetics 140A

      ページ: 291-293

  • [雑誌論文] A SNP in the ABCC11 gene is the determinant of human earwax type.2006

    • 著者名/発表者名
      Yoshiura et al.
    • 雑誌名

      Nature Genetics 38

      ページ: 324-330

  • [雑誌論文] Alphoid DNA from different chromosomes forms de novo minichromosomes with high efficiency.2005

    • 著者名/発表者名
      Kaname et al.
    • 雑誌名

      Chromosome Research 13

      ページ: 411-422

  • [雑誌論文] Two novel mutations of the FGD1 gene in Japanese patients with Aarskog-Scott syndrome.2005

    • 著者名/発表者名
      Yanagi et al.
    • 雑誌名

      Ryukyu Medical Journal 23

      ページ: 143-148

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公開日: 2007-04-02   更新日: 2016-04-21  

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