| 研究課題/領域番号 |
17590340
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| 研究機関 | 名古屋大学 |
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研究代表者 |
村雲 芳樹 名古屋大学, 大学院医学系研究科, 助教授 (40324438)
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| 研究分担者 |
川井 久美 名古屋大学, 医学部附属病院, 助手 (50362231)
時々輪 真由美 名古屋大学, 大学院医学系研究科, 助手 (50378006)
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| キーワード | 損傷トレランス / REV7 / DNA修復 / 損傷乗り越え型DNA複製 / ノックアウトマウス |
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| 研究概要 |
平成18年度は、前年度に引き続きREV7のノックアウトマウス作成のため、ES細胞の相同組み換え体の同定を進めた。新たに構築したREV7のノックアウトベクターをマウスES細胞にエレクトロポレーションにて導入し、G418耐性クローンを約750クローンpick upした。そのクローンからゲノムDNAを抽出し、相同組み換え体の同定を、PCR法を用いて行った。しかし、PCRの反応条件を様々に変えて検討するも、組み換え体は同定できなかった。PCRが掛かりにくい部位である可能性も考えて、ラジオアイソトープを用いたサザンハイブリダイゼーション法にて、PCR産物を確認してみたが、陽性クローンは同定できなかった。今回、多くのクローンをスクリーニングしたが、それでも相同組み換え体が同定できなかった原因として、1)相同組み換え部位として用いた部位では、相同組み換えが起こりにくい、2)PCRの掛かりにくい部位であり、スクリーニングの方法に問題があった、等が考えられた。そのため、相同組み換え部位を変更し、マウスREV7 locusのエクソン1のスタートコドンからエクソン6までを欠損させるノックアウトベクターを新たに構築した。スクリーニングにはサザン法を用いるように制限酵素部位を考慮して設計した。今後、このノックアウトベクターを用いて、再度ES細胞に導入し、相同組み換え体を同定してノックアウトマウスの解析を進めたいと考えている。
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