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近年、熱帯熱マラリア原虫の機能分子の解析に遺伝子座破壊の手法が用いられているが、遺伝子座を破壊した「ノックアウト」原虫クローンの作製には早くても3-4ヶ月と、非常に時間がかかる。そこで、本研究では、アンチセンス鎖を原虫内で生成し、標的遺伝子のメッセンジャーRNAに相補的に結合させることにより、標的タンパク質の発現をノックダウンする手技を確立することを目的とした。昨年度は、EBA-175を標的としたアンチセンス・コンストラクトを作成し、薬剤選択下でエピゾームのプラスミドを保持する原虫を得ることが出来た。ところが、薬剤運択マーカーのプロモーターからの転写装置そのもの、あるいは逆方法への転写産物により、アンチセンス鎖側の転写産物がサイレンシングされている知見が得られた。この問題を克服すべく、Head to head方向にプロモーターを配列したコンストラクトを構築しなおした。また、昨年度に作製した安定的ノックダウン用基本コンストラクト中の薬剤耐性マーカー遺伝子をレポーター遺伝子であるルシフェラーゼに組み換えることで、一過性ノックダウン用基本コンストラクトを作製した。遺伝子座が破壊できず赤血球期原虫の生存に必須であるama-1およびrhoph2と言う遺伝子に対する一過性ノックダウン用コンストラクトを作製し、熱帯熱マラリア原虫に遺伝子導入し、原虫タンパク質を回収し、ルシフェラーゼ・アッセイを行ったが、著名な差は見出せなかった。一過性の発現系では、原虫が発現するルシフェラーゼの量が少なく、検出感度が低いためと思われる。
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