| 研究課題/領域番号 |
17590632
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 三重大学 |
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研究代表者 |
渡邉 省三 三重大学, 保健管理センター, 教授 (20134934)
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| 研究分担者 |
垣内 雅彦 三重大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (70214244)
小西 正芳 三重大学, 保健管理センター, 助教授 (00397514)
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| キーワード | C型肝炎ウイルス / 試験管内増殖 / IMY細胞 / 免疫電子顕微鏡 |
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| 研究概要 |
IMY-N9細胞にT7RNAポリメラーゼプロモーター下流に全長HCVcDNAを結合した発現ベクターをトランスフェクションし、さらにこの細胞にT7RNAポリメラーゼ組み換えアデノウイルス感染させ、この細胞内にHCV関連蛋白が発現していることを各種抗HCV抗体を用いた蛍光抗体法を行うことによって確認した。
また、この細胞ホモジェネイト中のプラス鎖とマイナス鎖のHCVRNAの存在をNothern blot法で検出するとともに、HCVのコア、E1、E2、NS3、NS4、NS5などのHCV関連蛋白が確かに発現していることをWestern blot法で確認することができた。
このIMY-N9細胞の培養上清中に検出されたHCVRNAは、real time PCR法による定量では10^7〜10^9copies/mlのレベルであり、このHCV含有培養上清を用いて10%-60%不連続蔗糖密度勾配遠心法によるHCVビリオンの分離精製を試みている。
この操作によって採取した分画試料中のreal time PCR法によるHCVRNAの分布は単一ではなく、比重1.06〜1.08g/ml、1.12〜1.17g/ml、1.22〜1.25g/mlなどの分画試料中にHCVRNAの含有量が多く、これら分画試料について電子顕微鏡観察を行うと、比重1.12〜1.17g/mlの試料中には直径55〜65nmの球形粒子、比重1.22〜1.25g/mlの試料中には直径33〜40nmの球形粒子が少数ではあるが検出されているので、これらの試料について、抗HCVE1抗体、抗HCVE2抗体、抗HCVコア抗体を用いた免疫電子顕微鏡を行って試験管内細胞感染材料の選別と収集を行っているところである。
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