| 研究課題/領域番号 |
17590632
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| 研究機関 | 三重大学 |
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研究代表者 |
渡邉 省三 三重大学, 保健管理センター, 教授 (20134934)
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| 研究分担者 |
垣内 雅彦 三重大学, 大学院医学系研究科, 助教授 (70214244)
小西 正芳 三重大学, 保健管理センター, 助教授 (00397514)
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| キーワード | C型肝炎ウイルス / 試験管内増殖 / IMY細胞 / 免疫電子顕微鏡 |
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| 研究概要 |
前年度に引き続き、IMY-N9細胞にT7RNAポリメラーゼプロモーター下流に全長HCVcDNAを結合させた発現ベクターをトランスフェクションし、さらにこの細胞にT7RNAポリメラーゼ遺伝子組込みアデノウイルスを感染させる実験を行い、細胞内のHCV関連蛋白の発現状況を各種抗HCV抗体を用いた蛍光抗体法とWesternblot法で確認し、細胞中のプラス鎖およびマイナス鎖HCVRNAの存在はNorthernblot法で確認することができた。
このトランスフェクッシン・インフェクション法によって細胞培養上清中に放出されるHCVRNA量は10^7〜10^9copies/mlであり、この上清を用いてショ糖密度勾配遠心法によるHCV粒子の分離精製を行った。遠心分画試料についてHCVRNAの解析と電子顕微鏡観察を行い、比重1.12〜1.17g/mlの分画には直径55〜65nmの球形粒子、比重1.22〜1.25g/mlの分画には直径33〜40nmの球形粒子を小数認めた。さらに抗HCVE1、E2、core抗体を用いた免疫電子顕微鏡を行って、これらの粒子がHCVであることを確認した。
次ぎに、HCVに対する感染感受性が報告されているIMY-N9細胞およびHuh7.5細胞、HCV非感受性陰性コントロールのサル腎臓由来COS7細胞を検討対象として、前述したHCV含有培養上清と精製分画試料を培養細胞上に添加して試験管内感染実験を行い、それぞれの細胞培養上清中のHCVRNA量の経時的推移を検討した。精製分画試料の添加ではすべての細胞の培養上清中にHCVRNAを検出することはできなかったが、HCV含有培養上清添加実験によって、IMY-N9細胞ではHCV曝露後2日目まで、Huh7.5細胞では1日目まで培養上清中のHCVRNAが陽性であった。陰性コントロールのCOS7細胞では1日目で既に陰性であった。細胞内のHCVRNA量、マイナス鎖HCVRNAの測定を行い、これらの細胞での試験管内感染・増殖の有無について詳細に検討を進めているところである。
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