| 研究課題/領域番号 |
17590822
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| 研究機関 | 新潟大学 |
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研究代表者 |
矢尾板 永信 新潟大学, 医歯学系, 助教授 (00157950)
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| 研究分担者 |
山本 格 新潟大学, 医歯学系, 教授 (30092737)
田中 憲一 新潟大学, 医歯学系, 教授 (10126427)
吉田 豊 新潟大学, 医歯学系, 講師 (40182795)
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| キーワード | 腎臓 / 糸球体 / 足細胞 / 細胞間接着装置 / コネキシン43 / 細胞傷害 / 初代培養 / ポドサイト |
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| 研究概要 |
1.培養系でのポドサイト傷害アッセイ系の確立
(1)ポドサイト初代培養系の確立:磁気ビーズを腎動脈より灌流し、腎皮質を細切した後、コラゲナーゼで消化、メッシュを通してさらに腎を細かくした。この組織片から磁石で糸球体を集め培養を試みたところ、およそ5×10^5のオーダーのポドサイトを得ることができた。これにより、定量的な実験に用いることのできるの数の初代培養ポドサイトを得ることが可能となった。
(2)培養における細胞傷害モデルの確立:培養細胞として、より培養の簡単なラット腎上皮細胞(NRK52E細胞)を用いて細胞傷害モデルを検討した。in vivoでは、puromycin aminonucleoside(PAN)腎症を用いるが、培養系ではin vivoに相当するPANの濃度と時間では傷害が起こらなかったため、同じ活性酸素の産生によって細胞を傷害するmenadioneにて検討した。50μM以上の濃度で30分以内に高度に細胞傷害を惹き起こしてくることが分かった。
(3)ポドサイト初代培養への遺伝子導入の検討:DNAの導入試薬として、Effectene、Superfect、Lipofectamine、FuGENE6、TransIT、Nucleofectorを用いた。ポドサイト初代培養への導入効率が高かったものは、TransIT、Nucleofectorで、リポフェクション系試薬は、1%前後の効率であった。
以上の結果より、ポドサイト初代培養系を用いて、menadioneによる細胞傷害に対してコネキシン43のノックダウンがどのような効果をもたらすかが、検証可能となった。
2.ポドサイトの細胞関節着構成成分の同定
細胞膜に富む画分のLC-MSMSを用いた網羅的解析では、有用な情報を得ることができなかった。そのため、コネキシン43を中心に膜画分の精製、免疫沈降を行い、解析を行う予定である。
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