| 研究概要 |
我々は、進行性腎障害共通の分子メカニズムを明らかにするために、5/6腎臓摘出ICR.マウスの腎肥大期において発現の上昇する遺伝子のスクリーニングを行った(Zhang H et al. Kidney lnt 56(2),549-558,1999)。得られた遺伝子のうちNX-17は様々な臓器のノーザン解析から、腎臓特異的に発現することが明らかとなった。この遺伝子の全長のcoding sequenceをマウス、ヒト、ラットにおいてクローニングしたところ、まったく新規の遺伝子であることが判明した。その遺伝子産物は222アミノ酸残基からなり、N末端にシグナルペプチドと膜ドメインを有する膜蛋白である。 ln situ hybridizationやポリクローナル抗体による免疫染色の結果、腎皮質部及び髄質部の集合管特異的に発現することが判明した。そこで我々はこの新規膜蛋白をcollectrinと命名し報告した(Zhang H et al. JBiol Cli ein 276(20),17132-17139,2001)。
Collectrinの細胞内ドメインに結合する蛋白のスクリーニングをYeast two hybrid systemを用いて行った。マウス腎臓mRNAを抽出し、 MATCHMAKER Library constmction ＆ Screening Kit(CLONTECH)を用いて、 cDNAを合成し、 pGADT7-Recベクターに挿入しライブラリーを作製した。一方collectrinの細胞内ドメインをpGBKT7ベクターにサブクローニングして、 baitとして用いた。その結果6種類の独立したクローンを得た。そのひとつがsnapin(Synaptaosomal-associated protein 25 binding protein)であった。 CollectrinとSNARE complexとの関係が示唆されたため、各種集合管細胞株(mlMCD-3,mlMCD-K2,RCCD1,RCCD2)のSNARE complexの構成分子の確認を行った。 PCR法を用いて、SNAP-23,syntaxin-4,VAMP-2の集合管培養細胞での発現を確認した。さらに免疫沈降法によってこれらの分子が複合体を形成していることが確認できた。
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