| 研究課題/領域番号 |
17590843
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 共立薬科大学 |
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研究代表者 |
細山田 真 共立薬科大学, 薬学部, 助教授 (00291659)
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| 研究分担者 |
市田 公美 東京慈恵医科大学, 医学部, 講師 (80183169)
森崎 隆幸 国立循環器病センター(研究所), バイオサイエンス部, 部長 (30174410)
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| キーワード | 尿酸 / トランスポーター / ノックアウトマウス |
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| 研究概要 |
1)尿酸トランスポーターURAT1のマウス遺伝子(slc22a12)のクローニング
ゲノムDNAファージライブラリーから非RIプラークハイブリダイゼーション法により、約15kbpのマウスURAT1遺伝子(slc22a12)クローンをクローニングした。
2)マウスURAT1遺伝子ターゲッティングベクターの作成
slc22a12配列の第1エキソン上流のEcoT22Iサイトと第4イントロン内のBan IIIサイトの間にネオマイシン耐性遺伝子pMC1Neo-polyA(positive selection marker)を逆方向に挿入し、下流末端部のNot Iサイトにジフテリア毒素A遺伝子pSK-DTA(negative selection marker)を順方向に挿入して、targeting vectorを構築した。
3)ES細胞のトランスフォーメーションとスクリーニング
targeting vectorを直鎖状にした後に、エレクトロポーレーション法によりマウスES細胞にトランスフォーメーションし、ネオマイシンにより選別培養を行った。PCRにてslc22a12の相同組み換えが認められたES細胞クローンのgenomic DNAのgenomic southern blottingを行ったところ。野生型では3.7kb/13.8kb、変異体では2.9kb/12.4kbが認識された。
4)ノックアウトキメラマウスの作出
胚供給用C57BL/6メスマウスに誘起排卵処置を施したのちに胚盤胞期胚を採取した。slc22a12のターゲッティングが認められたES細胞クローンを胚盤胞期胚に注入し、仮親メスマウスの子宮へ移植することによりノックアウトキメラマウスが得られた。
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