2005 年度実績報告書

ニューロンの酸化的リン酸化と活性酸素種産生におよぼすアミロイドβの影響

研究課題

研究課題/領域番号	17590892
研究種目	基盤研究(C)
研究機関	慶應義塾大学
研究代表者	佐藤秀樹慶應義塾大学, 医学部, 助手 (60296556)
研究分担者	阿部貴人慶應義塾大学, 医学部, 助手 (30365233)
キーワード	アミロイドβ / 酸化的リン酸化 / ミトコンドリア / 活性酸素種 / ニューロン / 一酸化窒素 / 酸化ストレス / dichlorofluorescein
研究概要	まずアミロイドβがニューロンの代謝に与える影響、とりわけ解糖系vs酸化的リン酸化の変化に注目して酵素活性、代謝率、NADPH含有量の変化、抗酸化物の含有量の変化などを評価した。ニューロンおよびアストログリアのアミロイドβへの曝露としては、Aβ_<1-42>を含んだメディウムで細胞を培養した。2μMのAβ_<1-42>で4日間反応させ、解糖系、酸化的リン酸化、ROS産生を評価した。Depositを形成していないAβ_<1-42>そのものからはROSは産生されないとの報告もある。メディウム中に各種ROS産生系を加えることでアミロイド障害性をモデル化し、ニューロン、アストログリアの解糖系、酸化的リン酸化、細胞内でのROS産生を測定した。また、アミロイドの沈着を促す条件(globular Aβ)での測定を試みている。 ROSの測定方法として、蛍光色素による測定を行う。Superoxide anionの測定としてhydroethidine (HE)、hydroxyl radicalおよびhydrogen peroxideの測定としてdichlorofluorescein (DCF)、nitric oxide (NO)の測定として4,5-diaminofluorescein diacetate (DAF-2 diacetate)を用いている。Xanthine/ xanthine oxidaseによるsuperoxide産生系、hydrogen peroxideとperoxidaseによる反応、各種NOドナー化合物を利用して、蛍光色素の感度、選択性、キャリブレーションを行う。今後は古典的なROSの測定法を併用していく。Cytochrome C還元法、Griess反応、spin-trap法などである。