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βHC-9細胞から抽出したmRNAよりBTC(1-80)とBTC(24-76)のcDNAをRT-PCR法にて作製、pGEXシリーズのplasmid vectorに組み込んだ。そして、大腸菌からfusion蛋白としてBTC(1-80)とBTC(24-76)を抽出・精製しそれぞれのカラムを作成した。BTC受容体を発現していると思われるIEC-6細胞を大量に培養後、whole cell lysateを作製、更に膜分画のみを抽出し、その膜分画のみをそれぞれのカラムにapplyした。BTC(1-80)またはBTC(24-76)に対する結合蛋白をカラムより回収し、SDS-PAGEに展開した。そしてbandをgel染色システムにて可視化することを試みた。しかし、bandを可視化することは出来なかったので、gelを渡銀染色し、BTC(24-76)に結合しBTC(1-80)に結合しないbandを複数回収した。
現在、質量分析法を用いてシークエンスを明らかにし、data baseより分子を同定する作業を進めている。
更に、BTCをリガンドとしてprotein array法を用いてBTCへ結合する分子のスクリーニングももう一つの方法として実施した。現在結果を解析中である。
現在迄に得られたクローンでは、残念ながら受容体構造を有するクローンは得られていない。しかし、興味深いことに全く新しいクローンとしてsec6のホモログを見出した。受容体等のdocking/fusionに関与するクローンと思われるので今後の機能解析が待たれる。
当面は回収したサンプルにどのような分子が含まれているかの解析を継続、終了させる予定である。
万が一、今回の検討で受容体をクローニング出来なかったとしても、上述のクローンを得ており全く無駄に終わるプロジェクトではないことが現時点で判明している。
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