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本研究は、PDE3Bに相互作用しインスリンによりリン酸化されるp50のクローニングおよびそのその解析を目的とし、そのアプローチとしては1)yeast two-hybridにて既に得られている候補クローンの網羅的解析、2)燐酸化p50の分離、質量分析による同定を計画した。
平成工8年度は、平成17年度に引き続き、yeast two-hybridにて既に得られている候補クローンの解析を主に行った。平成17年度にyeast two-hybridの2次スクリーニングおよびin vitroのreticulocyte lysateで合成した^<35>S標識PDE3Bを用いたGST pull downによりPDE3Bとの相互作用を確認した11クローンについて、ラット脂肪細胞の内因性PDE3Bとの相互作用の解析を行った。これら11クローンそれぞれのGST融合蛋白およびラット副睾脂肪細胞の可溶化膜分画を用いGST pull downを行い、抗PDE3B抗体を用いたWestern blot法ににより相互作用を検討した。その結果、11クローン中、キナーゼおよび転写因子を含む7クローンでラット脂肪細胞の内因性PDE3Bとのin vitroでの相互作用が確認された。
さらに、11クローンについてそれぞれの蛋白に対する抗体を、GST融合蛋白をウサギに免疫することにより作成した。これちの抗体を用いて、得られたクローンの脂肪細胞内でのPDE3Bとの内因性の相互作用について、免役沈降法、Western blot法により、一部を解析した。
本研究により、p50の候補としてキナーゼおよび転写因子を含む7クローンを限定した。さらに、本研究によりPDE3Bはp50および我々がすでに報告した14-3-3β以外に複数の蛋白と相互作用することが示唆された。
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