| 研究課題/領域番号 |
17590941
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
宮村 信博 熊本大学, 医学部附属病院, 講師 (40274716)
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| 研究分担者 |
古川 昇 熊本大学, 医学部附属病院, 医員 (90335795)
田口 哲也 熊本大学, 医学部附属病院, 医員 (30398200)
荒木 栄一 熊本大学, 大学院・医学薬学研究部, 教授 (10253733)
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| キーワード | 肝細胞 / インスリン受容体 / 転写因子 / DNAアフィニティーカラム / TCCCTCCC配列 / プロモーター解析 / プロテオミクス |
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| 研究概要 |
インスリン受容体の発現量は組織特異的な調節をうけていると考えられているが、詳細は明らかではない。我々の研究室ではヒトインスリン受容体遺伝子のプロモーター領域を単離・解析し、細胞特異的な転写調節領域が存在すること、これに結合する細胞特異的な転写因子について検討を行ってきた。その結果、既に新しい肝特異的な転写調節因子が存在することを確認している(Biochem Biophys Res Commun, 280:428-434, 2001)。この肝臓特異的インスリン受容体転写調節因子を同定することを目的とした。
申請者らが同定したインスリン受容体遺伝子プロモーター上の肝細胞特異的転写調節領域(-588〜-581:TCCCTCCC)をタンデムに結合させたオリゴヌクレオチド(TCCCTCCC×6=24mer)をCNBrセファロースカラムに結合させ、目的核蛋白の精製のためのDNAアフィニティーカラムを作製した。このカラムにヒト肝細胞癌株HepG2細胞およびマウス肝より調整した粗抽出核蛋白をアプライした後、0.1M KCL溶液にて洗浄して非特異的結合蛋白を排除し、続いて0.5Mおよび1.0M KCL溶液にて結合核蛋白を抽出した。TCCCTCCC配列をプローブとして用いたゲルシフトアッセイとサウスウエスタンブロットにより、目的核蛋白の回収を確認することができた。今後はプロテオミクス解析のために目的核蛋白の精製度と回収量を改善するために、DNAアフィニティーカラムにアプライする前の粗抽出核蛋白の前処理を行っていく予定である。
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