| 研究課題/領域番号 |
17590942
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| 研究機関 | 熊本大学 |
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研究代表者 |
水流添 覚 熊本大学, 医学部附属病院, 助手 (50398202)
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| 研究分担者 |
宮村 信博 熊本大学, 医学部附属病院, 講師 (40274716)
西田 健朗 熊本大学, 医学部附属病院, 助手 (50336244)
豊永 哲至 熊本大学, 大学院・医学薬学研究部, 助手 (60295128)
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| キーワード | 膵β細胞 / インスリン分泌 / CaMキナーゼII |
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| 研究概要 |
カルシウム(Ca)、カルモデュリン(CaM)依存性プロテインキナーゼIIδ2(CaMキナーゼIIδ2)は膵β細胞の調節性インスリン分泌に重要な役割を担う。肥満やインスリン抵抗性状態による代償性インスリン分泌亢進はCa/CaM系の慢性的活性化をもたらすが、これが転写制御や細胞増殖を含めた膵β細胞機能に及ぼす影響は不明である。本研究は恒常活性型CaMキナーゼIIδ2発現系を構築し、培養膵β細胞株に導入することで、インスリン合成・分泌応答、細胞増殖とCaMキナーゼIIδ2の連関を解明することを目的とする。
我々はマウス脳より単離されたCaMキナーゼIIδ2cDNAを基にSite-directed mutagenesisの手法で以下の2つの変異CaMキナーゼIIδ2cDNAを作成した。(1)活性型変異体CaMキナーゼIIδS-act:調節サブユニットのスレオニンをアスパラギン酸に置換したもの(T287D)(2)非活性型変異体CaMキナーゼIIδ2-kd:触媒サブユニットの活性中心部のアミノ酸置換(K43A)。上記cDNAをpShuttle2ベクターに載せ換えた後、BD-Adeno-X Viral DNAベクター(BD bioscience社)へ導入しアデノウイルスを得た。
一方、CaMキナーゼIIの内在性阻害ペプチドCaM-KIINαおよびβ(ラット由来)のシークエンスを元に、マウスgenomic DNAデータベースを検索し、各マウスorthologueを染色体4および16に同定した。この情報を元にPCRプライマーを設計、マウス脳および膵β細胞株MIN6よりRT-PCR法にてマウス由来のCaM-KIIN cDNAを単離した。単離したcDNAをpShuttle2ベクターに載せ換えた後、BD-Adeno-X Viral DNAベクターへ導入しアデノウイルスを得た。現在上記アデノウイルスの膵β細胞株への導入と、発現確認を行っている。今後、細胞機能解析を進行する予定である。
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