研究課題
1.ヒトRetinoic acid receptor-related orphan receptor α(RORα)、RORβ、RORγおよびREV-ERBαのDNA断片全長をサブクローン作成した。ヒトRORα、RORβ、RORγおよびREV-ERBαのcDNA全長の特異的DNA断片は、肝臓(CLONTECH)のcDNAライブラリーから、pCI-neo哺乳類発現ベクター(Promega,米国ウィスコンシン州)へとサブクローンし作成した。RORα、RORβ、RORγ、REV-ERBαは、Sal I/Not l断片をpCI-neoのSal I/Not Iサイトにサブクローン作成し、ベクターをそれぞれpCI-RORα、pCI-RORβ、pCI-RORγまたはpCI-REV-ERBαとした。2.レポーターアッセイ用のヒトPPARα、PPARδ、PPARγの上流領域のサブクローン作成をした。ヒトPPARα、PPARδ、PPARγの蛋白開始コドンの上流2kbpを産生させるようにプライマーをそれぞれ設定し、肝臓(CLONTECH)あるいは脂肪(CLONTECH)のcDNAライブラリーから、ヒトPPARα、PPARδ、PPARγのプロモーターを含む領域を含むクローニングベクターを作成し、さらに、レポーターアッセイ用のルシフェラーゼ遺伝子(pGL3-Basic)のpGL3-Basic上流側に、サブクローンした作成したヒトPPARα、PPARδ、PPARアのプロモーターを含む領域をそれぞれライゲーションし、それぞれを、pPPARα-Luc、pPPARδ-Luc、pPPARγ-Lucと名付けた。3.時計遺伝子およびROR群、REV-ERBαのPPAR転写活性化に関するレポーターアッセイを実施した。レポーターアッセイ用の一時的な細胞内導入は、TfxTM-50試薬(Promega)を用いた。PPARの活性化を測定するために、ルシフェラーゼ遺伝子(pGL3-Basic)のpGL3-Basic上流側のKpn I/Nco Iサイトにクローン化した細胞性レチノール結合タンパク質タイプII(cellular retinol binding protein II : CRBPII)を調製し、pCRBPII-LucおよびpRL-TKは、BMALl、CLOCK、ROR群、REV-ERBαを加えた場合と加えない場合とで、pCI-RXRαを加えて、時計遺伝子およびROR群、REV-ERBαがPPARの転写を活性化するか検討し、その活性が上昇するこを証明した。
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Metabolis In press
J immunoassay and Immunochemistry In press
