| 研究概要 |
以前クローイングしたPPAR群、BMAL1、CLOCK、ROR群、REV-ERB群が、それぞれ、蛋白-蛋白結合するかどうか、加えて、PPAR群のプロモーターがBMAL1、CLOCKによって変動するか検討した。pGEX-4TのBamH Iサイトにクローン化したPPAR群遺伝子を、GST-PPARs融合タンパク質としてEschelichia coliにおいて発現させ、ビオチン標識したin vitro translation (TNT T7 Coupled Reticulocyte Lysate System, Promega) BMAL1、CLOCK、ROR群、REV-ERB群、それぞれを2μL、および試験化合物の50mmol/L溶液を10μLを加えたNETN緩衝液1000μL中で、4℃で一昼夜実施した。恒温処理後、400〜1,000×gで3分間の遠心分離により上清を除去し、固定化した融合タンパク質を、ミルクを加えないNETN緩衝液で3回洗浄し、洗浄後、グルタチオン-セファロースに結合させたタンパク質を窒素ガス下で乾燥させてから、SDSサンプル緩衝液に再懸濁させ、SDS-PAGEで分析した。以上の実験より、明らかに、PPAR群とBMAL1、CLOCK、ROR群、REV-ERB群がそれぞれ、蛋白-蛋白結合することが判明し、加えて、PPAR群のプロモーターがBMAL1、CLOCKによって明らかに変動することも明らかとなった。
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