| 研究概要 |
RNA interference libraryを使用した、成長ホルモン(GH)遺伝子のローカスコントロールリージョン(LCR)に結合する因子のクローニング
LCRの下流に、GHプロモーター、およびGreen Fluorescent Protein(GFP)cDNAを結合させたプラスミド(LCR-GH-GFPベクター)を作製した。さらに、このプラスミドに、CMVプロモーターと結合させたRed Fluorescent Protein(RFP)cDNAを挿入した。このプラスミドをマウス下垂体細胞株にトランスフェクトしたが、トランスフェクション効率が不十分であった。導入効率を改善ため,種々の検討を行ったが、十分に導入効率を上げることが困難であり、このレポーターベクターが導入された下垂体細胞株が得られていない。導入効率が改善した際には、RNA interference libraryと同時に導入し、セルソーターでGFP、RFP発現を指標とし、LCR結合因子の単離を試みることを計画していたが、実現していない。
GH産生細胞分化におけるGH遣伝子LCRの意義
LCR-GH-GFPベクターをES細胞のゲノムDNAに導入した細胞を樹立した。このES細胞を種々の条件下で,培養した。特定の条件下で、GH-LCR遺伝子下に位置するGFPの発現が増大することが確認できた。実際に,このとき内因性GH発現が増加しているか確認するため、GHをEIAで測定したところ、コントロールに比べ増加しており、この条件で、ES細胞からGH産生細胞の方向に分化させられる可能性が示唆された。同時に、LCRのGH産生細胞分化において作用している可能性が示唆された。ホルモンやグロースファクターによりGH産生細胞への分化を人為的に制御できないか検討した。GFP発現細胞数をセルソーターで定量する方法により評価したところ、予想外の結果であったが、LIFが最も分化促進活性をもっていた。
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