| 研究課題/領域番号 |
17590973
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| 研究機関 | 独立行政法人国立病院機構(京都医療センター臨床研究センター) |
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研究代表者 |
田上 哲也 独立行政法人国立病院機構(京都医療センター臨床研究センター), 内分泌研究部・分子内分泌研究室長 (60273439)
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| 研究分担者 |
森山 賢治 独立行政法人国立病院機構(京都医療センター臨床研究センター), 内分泌研究部, 研究員 (00301739)
成瀬 光栄 独立行政法人国立病院機構(京都医療センター臨床研究センター), 内分泌研究部, 部長 (40120018)
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| キーワード | 甲状腺ホルモン / 核内受容体 / 甲状腺ホルモン受容体 / クローニング / 転写因子 |
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| 研究概要 |
1.TRβ4遺伝子発現ベクターの構築
機能解析を目的として、クローニングした遺伝子をCMX発現ベクターのMCSに挿入(サブクローニング)し、塩基配列をシークエンサーで確認した。
2.発現実験
リン酸カルシウム法を用いて、ヒト胎児腎臓由来の細胞(293T)に応答配列(TRE)をもつルシフェラーゼ発現リポーター遺伝子(TRE-tk-Luc)あるいはネガティブフィードバックをうける遺伝子(TSH-Luc)とともにコトランスフェクション(遺伝子導入)し,発現蛋白の転写機能を解析した。
その結果、TRβ4単独では、有意な転写活性は観察されなかった。
3.共発現実験
機能的TRであるβ1/2やTRα1とAF-2を培養細胞にトランスフェクションし、機能的TRの機能に対する影響を観察した。対照として不応症から同定された変異TRβ1(RTHβ)やTRα2とその作用を比較した。その結果、TRβ4はTRα2と同程度に、RTHβsより軽度に、機能的TRの転写活性化能を阻害した。
4.In vivo DNA結合能
Promoter interferenceアッセイ法を応用し、TRβ4のin vivoにおけるDNA結合性を検証した。TSHプロモーターのTATAbox下流にTREを挿入し、TRがDNA(TRE)に結合するとルシフェラーゼ活性が阻害されることで結合性を半定量した。その結果、対照として用いたTRβ1/2やTRα1/2と同程度のDNA結合性が観察された。
5.ノザンブロット
市販のヒトRNAパネルを用い、TRβ4特異的プライマーでハイブリダイズし、各組織におけるTRβ4mRNAの発現量を比較検討した。その結果、約7kb(主)と約3kb(従)のバンドが同定され、骨格筋での発現が最も多く、RT-PCRの結果と一致した。次いで、前者は心臓と脳に、後者は肝に豊富であった。
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