| 研究課題/領域番号 |
17591174
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| 研究機関 | 九州大学 |
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研究代表者 |
皆川 洋子 九州大学, 大学院・医学研究院, 助教授 (70209823)
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| 研究分担者 |
師井 洋一 九州大学, 大学病院, 講師 (40264022)
吉開 泰信 九州大学, 生体防御医学研究所, 教授 (90158402)
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| キーワード | 単純ヘルペスウイルス / 免疫学 / 遺伝子 / トランスジェニック動物 |
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| 研究概要 |
皮膚に限局してHSV-1エンベロープ膜タンパク糖タンパクB(glycoproteinB,gB)を発現するトランスジェニックマウスを作成する目的で、gB遺伝子をケラチンを発現する細胞でのみ活性化するK14プロモーターの下流に接続したDNAを以下のとおり作成した。
K14-MCP-1-hGH introns poly Aコンストラクトが入ったpGEMプラスミド(4784bp)は、コンストラクトの両端が制限酵素EcoRI切断部位になっており、MCP-1cDNA断片(534bp)はBamHI切断部位によりK14プロモーターとhGHイントロンに結合している。このプラスミドを大腸菌DH5αに導入し、アンピシリン選択培地を用いて組換え大腸菌を増殖し、プラスミドDNAを回収した。制限酵素EcoRIおよびBamHIで切断し、アガロース電気泳動でプラスミド導入が確認できた大腸菌を培養・精製して得たプラスミドDNAから、MCP-1領域を切出したDNA断片(6993bp)を準備した(BamHI消化→電気泳動→断片の精製)。一方HSV-1 gB498-505(SSIEFARL)領域を含むDNA断片は、HSV-1感染Vero細胞から抽出・精製して得たHSV-1DNAを鋳型としてPCRを行い準備した。gB-DNA断片と前出K-14を含むMCP-1領域を切出したプラスミドDNA断片(6993bp)をライゲーション・キットを用いて連結した。新たに得られたプラスミドの塩基配列確認、大腸菌に導入、培養、プラスミド回収を行い、作成したコンストラクトによるgBの細胞膜上での発現誘導を、transfectionを用いて確認した。K14プロモーターが発現する培養細胞(HeLa)にリポソームを用いてDNA断片をtransfection後mouse anti-gB抗体を用いたflow cytometryに供しgBの細胞表面への発現を確認した。発現細胞溶解液をImmunoprecipitation/Western blot法に供してgB発現を確認する予定である。さらにgB498-505配列-MHC class I複合体を認識するペンタマー分子を用いてマウス細胞における発現を確認する予定である。
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