| 研究分担者 |
山上 裕機 和歌山県立医科大学, 医学部, 教授 (20191190)
岩橋 誠 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (70244738)
堀田 司 和歌山県立医科大学, 医学部, 講師 (50244744)
松田 健司 和歌山県立医科大学, 医学部, 学内助手 (30398458)
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| 研究概要 |
1.マウスユビキチン遺伝子およびヒトCEA発現adenovirus vectorの作製および調整
C57BL/6マウスのgenomic DNAから5'primer ; GGGCCATGGAAATCTTCGTGAAGACCCTGと3'primer ; ACACGGATCCCCACCGCGCAGACGCAGを用いたPCRによりマウスユビキチン遺伝子(76 amino acids)を増幅させ,遺伝子配列を確認した.ユビキチン遺伝子と以前当教室で作製したCEA遺伝子の融合は,ユビキチンモノマー塩基配列,イディオタイプ塩基配列,Kozak塩基配列,CEA塩基配列を結合させ,pIRES plasmid(Clontech)に導入し,融合遺伝子(pIRES-Ub/CEA)を作製する予定であるが,現在作成過程にある.同様に,コントロール遺伝子として,ユビキチン遺伝子のみのplasmid(pIRES-Ub)を作製中であり,それらを用いて、COS-TPC法にてユビキチン遺伝子・CEA遺伝子の融合遺伝子発現adenovirus vector(AxCAUb/CEA)、ユビキチン遺伝子発現adenovirus vector (AxCAUb)を作製予定である.
2.C57BL/6J-TgN(CEAGe)18FJPマウス(TgCEA)の骨髄細胞よりDCの誘導と遺伝子導入
TgCEAマウスの大腿骨,脛骨より骨髄細胞を採取し(約2×10^7/mouse),200U/mlのマウスGM-CSF(mGM-CSF)存在下に10-12日間培養後浮遊細胞を回収した.誘導したDCに種々のMOIでadenovirus vector(AxCACEA AxCAmGM-CSF)を遠心法(2000g,37℃,2hr)を用いて感染さ,それぞれの至適MOIを確認した.
総評:
本年度はベクターの作製に予想外の時間を費やすことなり,当初の計画目標には達しないが,次年度は,ユビキチンの発現確認,遺伝子導入DC接種TgCEAにおけるCTLの誘導能の検討,および皮下腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果の検討を行う予定である.
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