| 研究概要 |
I.化学療法開始直後に反応する分子マーカーの抽出
化学療法開始早期に細胞死に先立ち変化を来たす遺伝子の候補としてgadd153 (DNA damage inducible gene),p21,c-junを採用した。in vitroではヒト胃癌細胞株TMK-1,MKN-45,MKN-74を,低濃度〜高濃度5-FU,CDDPにそれぞれ曝露後,real time RT-PCRを用いて経時的に各遺伝子のmessenger RNA (mRNA)の発現を定量した。抗腫瘍効果はMTT assayを用いて判定し、無治療群を対照群とし治療群との比を求めた。in vivoではヒト胃癌細胞株TMK-1をヌードマウス背部皮下に移植し腫瘍を作成した後,低容量〜高容量の5-FU,CDDPを腹腔内投与した。薬剤投与後48時間に皮下腫瘍を回収し,m-RNAを同様に定量した。また、それぞれの薬剤濃度による抗腫瘍効果は薬剤投与後21日目に評価した。
II.当院で手術施行される進行胃癌症例を対象として,検体の抗癌剤感受性とマイクロアレイによる遺伝子発現の相関を検討した。感受性試験に用いた薬剤はマイトマイシンCアドリアマイシン,シスプラチン(DDP),5-FUである。薬剤感受性は前項と同じく3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-2Htetrazolium bromide (MTT)アッセイにより行った。
(1)RNAの抽出とcDNAの合成
RNA抽出に際しては,TRIZOLまたはSepasol-RNAI中に検体を加え,Polytronを用いて5秒間,15,000gで二回ホモジナイズした。クロロフォルムを添加し,15,000gで10分間遠沈し,RNAを含む液体を採取する。細胞の全RNAをイソプロパノールで沈降し,70%エタノールで洗浄し,DEPC処理水内に懸濁した。RNAを1.5unitのDNaseIで処理後,再度TRIZOL/クロロフォルムにより抽出し,エタノールで沈降し,DEPC処理水に溶解する。RNeasy Mini Kit (QIAGEN Hilden, Germany)を用いて,低分子のヌクレオチドを除去した。cDNAの合成はreverse Super Script Choice System (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)を用いて行う。cRNAはcDNAをテンプレートとして,MEGAscript T7 kit (Ambion, Austin, TX)を用いて合成した。
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