| 研究課題/領域番号 |
17591533
|
|---|
| 研究機関 | 東京女子医科大学 |
|---|
研究代表者 |
糟谷 英俊 東京女子医科大学, 医学部, 講師 (50169455)
|
|---|
| 研究分担者 |
赤川 浩之 東京女子医科大学, 医学部, 助手 (60398807)
井ノ上 逸朗 東京大学, 医科学研究所, 助教授 (00192500)
|
|---|
| キーワード | 脳動脈瘤 / 遺伝子 / マイクロアレイ / ゲノム |
|---|
| 研究概要 |
脳神経外科手術時、脳動脈瘤、海綿状血管腫、脳動静脈奇形の流入動脈、流出静脈、ナイダスの組織の摘出を行って遺伝解析に使用するサンプルの収集を行った。RNAの抽出は、凍結組織をTrizol reagent(Invitrogen)を用いて,氷上で2分間ホモジェナイズし、プロトコーに従って抽出を行っている。RNA量を測定し、その質をAgilent Lab-on-a-Chip 2100 bioanalyzerで確認する。また、DNAの混入は、DNase I(Promega)を用いて除去する。アジレント社のin-situオリゴDNAマイクロアレイキットを使用している。RNAの抽出後は、あらかじめ作成しているレファレンスを用いて、基本的には、アジレント社のプロトコールに添って実験を進めている。まず、Human 1A oligoDNA microarray kit(Agilent)を用いて50-500ngのtotal RNAから、double-stranded cDNAを作成する。これを用いてcyanine 3とcyanine 5でラベルしたcomplementary RNA(cRNA)を作成している。ラベルしたcRNAを抽出した後、アレイにハイブリダイゼイションを60℃17時間で行い、洗浄し乾燥する。同様の操作を、色素を交換して行う。Agilent microarray scannerを用いてアレイのスキャンを行い、それぞれの遺伝子の発現量は、Feature Extraction softwareを用いて解析している。データはLOWESS normalization methodを用いて正規化する。スライド上すべてに発現していた遺伝子を対象とし、バックグラウンドに比較して、シグナルの弱いものは除外する。また、色素交代によって、相関係数が正であるサンプルは除外の対象とする。今後、発現差の検定には、permutation法、クロスバリデーション、階層クラスタリング法などを用いて行う(Genespring、GeneSifterなどソフトを利用)予定。
|
