| 研究課題/領域番号 |
17591556
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| 研究機関 | 富山大学 |
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研究代表者 |
川口 善治 富山大学, 附属病院, 講師 (00262527)
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| 研究分担者 |
長田 龍介 富山大学, 附属病院, 助手 (40293310)
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| キーワード | 腰椎間板ヘルニア / 椎間板内治療 / si RNA / adamts-4,5 |
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| 研究概要 |
研究課題に対し、今年度は以下の検討を行った。
in vitroにおける椎間板細胞内での軟骨変性促進遺伝子の抑制実験
(1)髄核細胞の摘出
ラビット10匹をネンブタールにて犠牲に供し、その後無菌的に脊柱を摘出し、椎間板の髄核組織を無菌的に単離した。コラゲナーゼ処理をして細胞を単離した。
(2)髄核細胞のアルジネートビーズ内での三次元培養
摘出した髄核細胞を1.2%sodium alginateを用い、軟骨細胞分化培地(Takara)にて2週間3次元ビーズ内培養を行った。ビーズ培養後すぐに12 well plateに細胞を撒いて以下のトランスフェクションの実験に利用した。
(3)Knock down用RNAオリゴの作成
Knock down用のRNAは、これまでの文献的検討からadamts-4(aggrecanase 1)および、adamts-5(aggrecanase 2)の作製を行った。
(4)髄核細胞への遺伝子導入
リポフェクション法を用いて、rabbitadamts-4、adamts-5の遺伝子のmRNAに対するtarget sequenceの決定および、髄核細胞にトランスフェクションする条件を検討した。試薬はTakaraのtrans-it-TKOを用いて条件検討を行った。adamts-4に関しては、ウサギ髄核細胞での発現量が低く安定して発現が得られなかったため、十分にKnock down出来なかった。そこでIL-1刺激下でも同様にadamts-4の発現が十分得られるか確認したが、発現量は低く、Knock down出来なかった。adamts-5に関してはウサギ髄核細胞では、安定して発現しており、siRNAを投与したところ、約75%のknock down効率が得られた。これが1週間以上持続することも確認した。さらに安定型であるadamts-5 siRNA(Damacon社)を再度作成し直し、アルジネートビーズ培養下でknock downできるかどうかも検討を行ったところ、3次元培養下でも十分にRNAが導入され、knock downできることがわかった。
(5)ウサギ椎間板変性モデルadamts-5RNAオリゴの投与
ウサギ椎間板変性モデル(puncture model)を用いてadamts-5RNAオリゴの投与を行った。現在解析中である。
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