|
サイクリン依存性キナーゼインヒビター(CDKI)のなかのCip/Kipファミリー(p21、p27、p57)は、神経軸索伸展に阻害的に働くRho/Rho-kinase経路の活性をそれぞれ抑制することが報告されているが、CDKIの他のファミリーであるINK4ファミリーについては細胞周期関連以外の機能を解明した報告はない。そこでINK4ファミリーが、Cip/Kipファミリーと同様に神経軸索伸展作用を有し、末梢神経損傷後の機能回復に貢献しうるかどうかを解明するために研究を開始した。まずヒトcDNAライブラリーよりPCR法によりINK4ファミリー遺伝子(p16、p15、p18、p19)のクローニングを行った。細胞内局在の変化を調べるためにN端、およびC端にGFPを結合させたベクターを作製した。またGFPによる蛋白質三次元構造への影響によりその機能が減弱あるいは消失する可能性も考えられるため、より小さな分子量のmyc-tagを結合させたベクターの作製も行った。まずHEK293T細胞に強制発現させ、免疫染色法、およびウエスタンブロッティング法により発現の確認を行った。神経系の細胞であるN1E-115細胞(マウスニューロブラストーマ)へも強制発現させ、形態変化、および各種遺伝子発現の変化について観察を行った。またp21、p27がそれぞれスレオニン残基、セリン残基がリン酸化を受けることによってその局在を核内から細胞質へと変化させることから、INK4ファミリー遺伝子でも同様にスレオニン残基、セリン残基に対する変異体を作製し、その局在や機能に変化をもたらすかどうかについて検討を行った。
|
