| 研究課題/領域番号 |
17591570
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| 研究機関 | 神戸大学 |
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研究代表者 |
西田 康太郎 神戸大学, 大学院医学系研究科, 助手 (00379372)
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| 研究分担者 |
土井田 稔 神戸大学, 大学院医学系研究科, 助教授 (60237170)
秋末 敏宏 神戸大学, 大学院医学系研究科, 助手 (90379363)
黒田 良祐 神戸大学, 医学部附属病院, 講師 (80379362)
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| キーワード | 椎間板 / RNA干渉 / 遺伝子治療 / ラット / in vivo / Fas ligand |
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| 研究概要 |
(1)外因性Reporter遺伝子(in vivo)を用いた研究
SDラット尾椎椎間板を用いた。
麻酔下にラットの尾椎椎間板を展開し、直視下にplasmid遺伝子とマイクロバブルを混合したものを椎間板内に注入し、直ちに外部より超音波を照射した。定量的実験として、ウミシイタケおよびホタルルシフェラーゼ遺伝子を同時に椎間板内に導入し、ホタルルシフェラーゼの遺伝子発現抑制のみを目的としたsiRNAをコードするplasmid遺伝子を導入した。経時的に椎間板組織を回収し、組織内のシフェラーゼ遺伝子発現を定量した。ウミシイタケルシフェラーゼを内因性コントロールとして、ホタルルシフェラーゼ発現が特異的にどれだけブロックされているかを両者の比を用いて統計学的に検討した(n=7)。Negative controlとして、siRNAを導入しないものと、RNA干渉は引き起こさないが同様の遺伝子内容(配列は異なる)を含むscramble siRNAをコードするplasmidを用いた。結果として、少なくとも2週間まで、in vivoでのRNAiが観察された。
(2)内因性遺伝子の発現抑制(in vitro ＆ in vivo)
椎間板内で内因性に発現しているとされる種々の遺伝子抑制を同様の手技を用いて検討した。まずは我々が正常椎間板に発現しているとして世界に先駆けて報告したFas ligandの発現抑制を試みた。基礎実験として、ラットのFas ligand(FasL)発現を抑制するためにデザインされたsiRNAを用いて、in vitroで培養髄核細胞にこれを導入し、後日FasL発現が抑制されているかどうかをWestern Blottingならびに定量PCR法にて確認した。このsiRNAをplasmidに組み込み、plasmidから産生されたsiRNAでも同様にin vitroでFasL発現が抑制できることを確認した。
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