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ヒト骨髄より単核細胞を分離し、メチルセルロース中でGM-CSF存在下で培養して得られる細胞(主にCFU-GM)を回収し、破骨細胞前駆細胞として使用した。これらの細胞にレンチウィルスベクターを用いて遺伝子を導入する効率をGFPをマーカーとして調べたところ、30%くらいであることがわかり、以降の実験にこのレンチウィルスベクターを用いることとした。上記CFU-GMにレンチウィルスベクターを用いてHPV E6/E7を感染させて、ピューロマイシン存在下で16個のコロニーをピックアップした。これらのコロニーについてsoluble RANKLおよびM-CSF存在下で破骨細胞分化能を有するか検索中である。同時にhTERTを導入し、さらなる延命効果について検討中である。また、得られた16個のコロニーのうちのいくつかは、ストローマ細胞様であったため、現在そのCharacterizationを施行している。具体的には、ストローマ細胞としての表面抗原(Stro-1その他)を免疫染色にて確認している。また、骨芽細胞誘導培地にて骨芽細胞に分化するかをアルカリフォスファターゼ、アリザリンレッド、von Kossa染色等により確認中である。また、不死化遺伝子であるE6/E7の発現のタイミングが破骨細胞分化にたいして影響するかを調べるため、inducibleな(Tet on/offシステムを改良したもの)レンチウィルスベクターを用いて検討中である。さらには、上記のごとくヒト骨髄細胞から培養分離して用いた細胞にはストローマ細胞も入っているため、血球系細胞ひいては破骨細胞前駆細胞の比率を上げるため、ヒト末梢血単核細胞より分離したCD14陽性細胞を破骨細胞前駆細胞として不死化のターゲットとして用いる実験も開始した。
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