| 研究課題/領域番号 |
17591704
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 研究機関 | 東京医科大学 |
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研究代表者 |
伊藤 正裕 東京医科大学, 医学部, 教授 (00232471)
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| 研究分担者 |
寺山 隼人 東京医科大学, 医学部, 助手 (00384983)
内藤 宗和 東京医科大学, 医学部, 助手 (10384984)
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| キーワード | 移植 / AutoMACS / Green Mouse / busulfan / SCID / 精細管 / マウス |
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| 研究概要 |
本年度科研費で購入したAutoMACS(Miltenyi Biotec社)を用いて、マウスから10^7cells以上の脾臓細胞を分離し、マイクロビーズおよび分離カラムによりCD4およびCD8T細胞の単離する方法、およびFlow cytometer(Beckman Coulter社)を用いて分離したマウスリンパ球の割合を計測する方法を習得した。また、大阪大学微生物研究所の岡部勝教授より蛍光緑発色する2種類のグリーンマウス(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)C14-Y01-FM131Osb・C57BL/6-Tg(CAG/Acr-EGFP)C3-No1-FJ002Osb:精子以外のすべての細胞が蛍光緑発色・精子を含むすべての細胞が蛍光緑発色)の譲渡の了承を受け、生産および管理している理化学研究所・バイオリソースセンターから2種類の雌雄3ペア取得し、生殖細胞移植実験のドナーマウスとして東京医科大学動物実験センター内で繁殖させることに成功した。さらに、移植する生殖細胞調整の前段階として、グリーンマウスと同じ系統の3〜4週令(elongated spermatidsが精細管に現れる前の週令)のC57BL/6マウスを用いて生殖細胞数を計測し、10^7〜10^8/ml cells分離し移植可能である事を確認した。そして、インジェクション用ガラス管(1.0×90mm、Narishige社)にガスバーナーで熱を加えて、萎縮した精細管に移植可能な外径約50um前後に伸張させ、自作のインジェクション装置を作成し、トリパンブルーを用いて精細管内に注入(約10ul)する練習を重ね、精細管内注入法を確立した。レシピエントマウスとして、雄ICRscidおよびICRマウスの精上皮をブスルファン(Sigma-Aldrich社)の量(25mg〜40mg/kg)やブスルファンの溶解方法(DMSOや生理食塩水の溶解量)など様々な方法で脱落させ観察し、その結果から投与方法(40mg busulfan/DMSO+生理食塩水300ul/mouseの腹腔内投与)や投与期間(4週間)を決定した。以上、本年度でグリーンマウスからブスルファン処理したマウスへ生殖細胞移植する準備がすべて整った。
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