| 研究概要 |
今年度は、機能未知遺伝子(PTP-X)のsiRNA抑制系を用いたin vivo, in vitroでの解析を行った。
まず、LacZとPTP-X特異的配列を標的にした配列を含むレトロウイルスベクターから作製したウイルスを感染させたES細胞から、LacZ陽性細胞を分離後、胚に導入し、得られたキメラマウスの解析を行った。得られた雄キメラ個体はコントロールでは6個体得られたが、PTP-Xノックダウンマウスからは1個体のみであった。両者から生後14週齢で凍結切片を作製し、分化段階特異的な抗体を用いて免疫染色を行った。PTP-Xノックダウンマウス切片は、GATA-1陽性セルトリ細胞は精細管周辺部に存在したが、Dmc1, SCP1陽性の減数分裂期の細胞は精細管内腔近辺に存在していた点と間質細胞が多い点がコントロールとは異なっていた。
in vitroの系ではin vivoで用いたsiRNA導入ES細胞をgerm cell系列へ分化させ、コントロ-ルと遺伝子抑制細胞との間での遺伝子発現解析を行った。ES細胞からEmbryoid bodyを形成後、SSEA1陽性細胞を分離し、これらの細胞をretinoic acid処理によりgerm cell系列へ分化させ、x-gal陽性、AP陽性細胞を得た。遺伝子が導入され、生殖系列へ分化したコントロール細胞とsiRNA抑制細胞について生殖細胞分化過程で発現している遺伝子の発現をRT-PCRで調べた。Oct3/4, PCNA, c-kit, Ddx1の精原細胞から精母細胞で発現している遺伝子の発現量は両者の間では差は認められなかったが、精子細胞発現遺伝子TSP57とRosbinは明らかに発現が低かった。
in vivo, in vitroの結果からPTP-Xの発現抑制により精子形成の分化抑制の傾向がみられた。しかし、in vivoでは個体数が少なかった為今後多くの個体発生を試み、さらに解析する予定である。
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