| 研究概要 |
本年度の研究実績
vectorの作成について
蛋白発現ベクター:gene bankより内耳有毛細胞への分化・機能獲得段階で発現するNotch,HES1,math1,Wntの遺伝子を検索し、open reading frameを含むように、OLIGO4.0(Macintosh)にてプライマーを作成し、胎児蝸牛よりRNA extraction kit(promega)を用いてRNAを抽出し、得られたRNAを鋳型としてPCRを施行。アガロースゲルに電気泳導し、得られたバンドをメスにて切り出しPCR産物を精製後制限酵素にて切断し挿入する遺伝子と蛋白発現ベクターをライゲーションした。挿入に成功したベクターを大腸菌に導入しアンピシリンを含むLB培地で選択し、培養させた大腸菌からprep kitにてベクターを抽出、得られたベクターに目的とする遺伝子が正しく挿入されているベクターは形質導入に使用するため保存している。
内耳多能幹細胞のセルラインの確立
胎生18週のマウスから蝸牛を取り出し抗生剤を含む生理食塩水で洗浄後、蝸牛を粉砕しナイロンメッシュにて濾過したのち、増殖因子を含む培養液で37℃で培養する。シャーレ内に浮遊し、球状に増殖する細胞塊のみを選択し、未分化神経細胞に陽性であるネスチンが陽性の細胞を分離し現在クローニング中である。
またそのクローニングした細胞を免疫染色にて形態学的、またRT-PCR,cDNAmicroarrayによる分子生物学的、検討を行い細胞の性格決定中である。
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