| 研究概要 |
組織多能幹細胞セルラインを確立し、その後内耳前駆細胞と共生させ栄養因子の発現についても、cDNAmicroarrayにて検討した。本検討によりさらに自然に近い細胞分化を目指すため、細胞への遺伝子操作(RNA干渉と形質導入)によりin vivoにおいて前駆細胞を分化させることを目的とした。
vectorの作成
A.蛋白発現ベクター:gene bankよりNotch, HES1,math1,Wnt Id1の遺伝子を検索し、open reading frameを含むように、OLIGO4.0(Macintosh)にてプライマーを作成する。胎児蝸牛よりRNAを抽出し、得られたRNAを鋳型としてPCRを施行する。アガロースゲルに電気泳導し、得られたバンドをメスにて切り出しPCR産物を精製後、制限酵素にて切断し、挿入する遺伝子と、蛋白発現ベクターをライゲーションする。挿入に成功したベクターを、大腸菌に導入し、アンピシリンを含むLB培地で選択し、培養させた大腸菌からprep kitにてベクターを抽出した。得られたベクターに目的とする遺伝子が正しく挿入されているベクターはANTISENCEとして、形質導入に使用するため保存した。
SiRNA(阻止RNA)ベクターの作成:遺伝子の発現を抑制するため、AmbionのpSilencerベクターに、OLIGo4.0を用いてsiRNAをデザインし、蛋白発現ベクターと同様に作成を行った。
1.内耳多能幹細胞のセルラインの確立
胎生18週のマウスから蝸牛を取り出し、増殖因子を含む培養液で培養する。シャーレ内に浮遊し、球状に増殖する細胞塊のみを選択し、未分化神経細胞に陽性であるネスチンが陽性の細胞を分離しセルラインとして使用し、細胞の形態的、分子生物学的検討を行い細胞の性格決定を行った。
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