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MYCN増幅細胞株であるNB-1を用い、MYCN塩基配列に特異的なsiRNAsを導入してRNA干渉を行う。siRNA導入後の細胞について、MYCN mRNA発現をreal time RT-PCRにて測定、ウエスタンブロッティングおよび免疫染色でMYCN蛋白発現を測定し、MYCN発現抑制を確認する。MYCN発現抑制後の細胞について、WST assayおよび細胞数の測定を行い、細胞増殖能の変化を検討する。またMYCN発現抑制後の細胞の形態学的変化、アポトーシスの亢進の有無を検討する。また、細胞分化の指標となるNGFレセプターおよびHa-rasの発現変化を検討する。
MYCN mRNAの発現レベルはsiRNA導入後、約30%以下まで抑制された。またウエスタンブロッティングにおいても発現抑制が認められた。免疫染色の結果、siRNA導入後は有意に核の染色が減弱することが判明した。以上により、RNA干渉によりMYCN発現がmRNAおよび蛋白レベルで抑制し得ることが明らかとなった。
さらに細胞増殖能の検討により、MYCN発現抑制後の細胞において、WST assayおよび細胞数測定により有意な増殖能の抑制が観察された。さらにこの細胞をTUNEL法で検索すると、アポトーシス陽性細胞が多数認められた。siRNA導入後には、神経突起の伸長が観察され、形態的に神経細胞への分化が認められた。同時にNGFレセプターであるTrkA、TrkCの発現が有意に亢進、TrkBの発現が低下していた。また、Ha-rasの発現において有意な変化は認められなかった。
以上により、MYCN増幅細胞であるNB-1に対し、RNAi干渉を用いることにより、MYCNの発現を30%以下にまで抑制し得た。MYCNの発現抑制により、細胞増殖抑制・アポトーシスの亢進および細胞分化が誘導された。
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