| 研究概要 |
【目的】農薬パラコート(PQ)の細胞毒性に関与するミトコンドリア(Mt)外膜酵素NADH-quinone oxidoreductase_m(NQO_m)は分子量約500kDの複合体蛋白質である。この構成蛋白成分を明らかにするため,以下の実験をおこなった。
【方法】1)ラット肝Mtの外膜より抽出したNQO_m画分を,抗voltage-dependent anion channel(VDAC)抗体で免疫沈降し,NQO_m活性を測定した。2)単離Mtをガラス底ディッシュに播種し,そのNQO_m活性を10mM PQと2mM NADHを基質としてdichlorofluorescein(DCF)蛍光法により検出した。活性に対する抗VDAC抗体およびインイオンチャネルブロッカーの影響を調べた。3)HeLa細胞にVDAC発現プラスミドを導入し,PQ添加後の細胞内H_2O_2生成量の測定および細胞毒性試験をおこなった。
【結果】1)抗VDAC抗体による免疫沈降後の上清中に含まれるNQO_m活性は,正常血清で処理したものに比べ低下していた。また,正常血清処理後の上清の活性は抗VDAC抗体を加えることで抑制された。2)単離MtにPQとNADHを同時添加するとH_2O_2生成による蛍光強度が対照に比べて増加した。PQまたはNADH単独では変化がなかった。同時添加による増加は抗VDAC抗体,陰イオンチャネルブロッカーDIDSにより抑制された。3)PQ添加によるVDAC高発現HeLa細胞の細胞内DCF蛍光強度は対照プラスミド導入細胞に比べて高い値を示した。また,VDAC高発現細胞の50%増殖阻害濃度は対照細胞に比べて低い値を示した
【考察】以上の結果よりVDACはNQO_mの構成蛋白質として,PQ毒性に関与していることが明らかとなった。
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