| 研究課題/領域番号 |
17591939
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
廣野 力 広島大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 助教授 (10199135)
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| 研究分担者 |
柴 芳樹 広島大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 教授 (90110452)
杉田 誠 広島大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 助手 (50235884)
岩佐 佳子 広島大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 助手 (70274090)
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| キーワード | Na^+-K^+-2Cl^-共輸送体 / 唾液腺 / 培養細胞 / 遺伝子導入 / パッチクランプ / 蛍光抗体法 |
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| 研究概要 |
本年度の研究実施計画に従い、解析に適した細胞系の確立とNa^+-K^+-2Cl^-共輸送体(野生型)Cl^-輸送活性の機能解析実験を行い、さらに変異型作製の研究を進めるため、以下の通り実施した。
1.解析に適した細胞系の確立
平成18年度に使用したラット耳下腺腺房細胞やCalu-3細胞よりさらに扱いやすいHEK294細胞にCa^<2+>・cAMPシグナル系の影響を受けない人為的なCl^-チャネルを組み込み、イオン電流が誘発されることを示した。さらにヒト由来のHEK294細胞に陽イオン性合成脂質リポソームを使用してラットのNa^+-K^+-2Cl^-共輸送体遺伝子(野生型)を導入し、ラットのNa^+-K^+-2Cl^-共輸送体蛋白質が発現することを蛍光抗体法で確認した。
2.Na^+-K^+-2Cl^-共輸送体(野生型)Cl-輸送活性の機能解析
グラミシジン穿孔パッチ陰イオン電流解析法を用いてラット顎下腺腺房細胞の陰イオン電流を測定し、α受容体刺激で誘導されるNa^+-K^+-2Cl^-共輸送体活性とCl^-チャネル活性がβ受容体刺激で抑制されることを明らかにした。交感神経刺激ではCa^<2+>シグナルとcAMPシグナルの相互作用によりCl^-分泌量ひいては唾液分泌量が減少することが示唆された。
3.変異型作製のための実験
野生型Na^+-K^+-2Cl^-共輸送遺伝子を大腸菌で増殖させ、増殖したDNAを含むプラスミドを回収・精製し、Na^+-K^+-2Cl^-共輸送遺伝子とベクターのサイズをゲル電気泳動で確認した。変異体作製のためのプライマーを設計し、現在、変異体の作製実験が進行中である。
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