| 研究課題/領域番号 |
17591939
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
機能系基礎歯科学
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| 研究機関 | 広島大学 |
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研究代表者 |
廣野 力 広島大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 助教授 (10199135)
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| 研究分担者 |
柴 芳樹 広島大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 教授 (90110452)
杉田 誠 広島大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 助手 (50235884)
岩佐 佳子 広島大学, 大学院医歯薬学総合研究科, 助手 (70274090)
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| 研究期間 (年度) |
2005 – 2006
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| キーワード | Na^+-K^+-2Cl^-共輸送体 / 唾液腺 / 培養細胞 / 遺伝子導入 / パッチクランプ / 蛍光抗体法 / Clチャネル / 電解質分泌 |
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| 研究概要 |
17年度〜18年度の研究実施計画に従い、以下の通り実施した。
1.解析に適した細胞系の確立
野生型のNa^+-K^+-2Cl^-共輸送体を有する培養細胞MDCKとCalu-3のNa^+-K^+-2Cl^-共輸送体活性をイオン電流として測定した。細胞内cAMPを上昇させるフォルスコリン刺激等で、持続性の低い陰イオン電流が記録された。また、HEK294細胞はヒトのNa^+-K^+-2Cl^-共輸送体に対する抗体で染色された。この細胞に陽イオン性合成脂質リボソームを使用してラットのNa^+K^+-2Cl^-共輸送体遺伝子(野生型)を導入するにあたり、ラットNa^+-K^+-2Cl^-共輸送体に対する抗体で、ラットのNa^+-K^+-2Cl^-共輸送体蛋白質が発現することが蛍光抗体法で確認された。変異体作製のためのプライマーを設計し、現在、変異体の作製実験が進行中である。
2.Na^+-K^+-2Cl^-共輸送体(野生型)Cl^-輸送活性の機能解析
Na^+-K^+-2Cl^-共輸送体Cl輸送活性のCa^<2+>・cAMP依存性機構解明のため、ラット耳下腺・顎下腺の分離腺房細胞のカルバコール(CCh)刺激時Cl電流へのβ受容体刺激の効果とノルアドレナリンによるα受容体・β受容体同時刺激の効果を調べた。CCh刺激でNa^+-K^+-2Cl^-共輸送体阻害剤のブメタニド感受性振動性内向き電流が誘導され、電流キャリアーはNa^+-K^+-2Cl^-共輸送体で細胞内に供給されるCl^-であることが示された。β受容体作用薬のイソプロテレノールや細胞内のcAMP産生を亢進させる同様の効果を持つforskolin+IBMXを添加すると振動性電流が抑制されたので、cAMPによるイオンチャネルやNa^+-K^+-2Cl^-共輸送体の活性低下が、電解質分泌を抑制し、唾液の水分分泌を減少させることが示唆された。α受容体刺激でもCCh刺激時と同様の結果が得られた。
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