| 研究課題/領域番号 |
17591945
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| 研究機関 | 北海道医療大学 |
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研究代表者 |
田隈 泰信 北海道医療大学, 歯学部, 教授 (40095336)
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| 研究分担者 |
荒川 俊哉 北海道医療大学, 歯学部, 講師 (40306254)
岡山 三紀 北海道医療大学, 歯学部, 助手 (30382500)
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| キーワード | siRNA / SNAREタンパク質 / 唾液腺 / 開口分泌 / 遺伝子ノックダウン / SNAP-23 |
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| 研究概要 |
唾液腺には多数のSNAREタンパク質とその調節タンパク質が発現しているが、唾液成分の開口分泌に直接関わるのがどのSNAREタンパク質であるか同定されていない。そこで、本研究では最近遺伝子の機能解析に広く取り入れられるようになってきているsiRNAによる遺伝子ノックダウン技術を応用し、開口分泌におけるv-SNAREおよびt-SNAREタンパク質の機能解析をおこなうこととした。
本研究では、唾液腺細胞を用いる研究の前段階として、siRNAおよびプラスミドの導入効率の高いHeLa細胞をモデル細胞とし、各SNAREタンパク質のmRNAを効率よく、しかも高い特異性をもって抑制するsiRNA、および、その発現ベクターの設計・構築を試みた。まず、t-SNAREの中で遺伝子ファミリーの構成員が最も少ないSNAP-23に着目し、SNAP-23のmRNAを抑制するsiRNA発現ベクターを数種類設計した。作製したsiRNAベクターの効果をプロメガ社製のsiCHECKシステムを用いて評価・定量したところ、残念ながら十分な抑制効果が認められなかった。そこで、次に合成した数種類のsiRNAを直接HeLa細胞に導入し、SNAP-23タンパク質の細胞レベルをウエスタンブロット法で調べることにより、90%近い抑制効果を示すsiRNAを見出した。
HeLa細胞の分泌活性は、ヒト胎盤由来の分泌型アルカリホスファターゼであるSEAPの発現ベクターをHeLa細胞に導入し、培養液に放出されるSEAP活性を測定した。コントロールsiRNAとSNAP-23に対するsiRNAを導入した細胞で、SEAPの分泌活性を比較したところ、有意な差は認められなかった。HeLa細胞にはSNAP-23遺伝子ファミリーに属する他のタンパク質は発現しておらず、HeLa細胞の構成的分泌には、SNAP-23は関与していないことが示唆された.
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